本文關(guān)鍵詞：CXXC鋅指蛋白5在上皮性卵巢癌中表達(dá)的臨床意義及其生物學(xué)功能研究

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【摘要】：研究背景和目的卵巢癌(ovarian carcinoma, OC)是最常見的女性惡性腫瘤之一,占女性生殖道腫瘤致死率的第一位,女性一生中患卵巢癌的可能性約1.4%。卵巢癌治療目前以手術(shù)治療為主,但大多數(shù)卵巢癌患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期,對(duì)卵巢癌化療藥物不敏感。卵巢癌近20年來進(jìn)展緩慢,從早期診斷到治療方案尚不明確,因此有必要闡明其發(fā)病機(jī)制,尋找有效的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物,用于卵巢癌的預(yù)后判斷及新藥研發(fā),從而降低卵巢癌的死亡率和提高生存率。CXXC鋅指蛋白5(CXXC finger protein 5, CXXC5),又名RINF(retinoid-inducible nuclear factor),屬于CXXC鋅指蛋白區(qū)域家族,是定位于5號(hào)染色體長臂5q31.3的35.5 KD大小的蛋白,編碼維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞核因子。最近的研究表明CXXC5參與多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞侵襲和能量代謝等。因此,CXXC5在人類多種疾病中扮演了重要的角色。目前CXXC5在腫瘤中的研究處于初始階段,S.Knappskog et al.發(fā)現(xiàn)同正常對(duì)照組織相比,CXXC5的表達(dá)在原發(fā)性乳腺癌、甲狀腺癌和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中高表達(dá),且在乳腺癌中CXXC5的高表達(dá)同總生存期短相關(guān)。他們使用同時(shí)提供生存和CXXC5mRNA水平數(shù)據(jù)的獨(dú)立基因表達(dá)芯片進(jìn)一步證實(shí)CXXC5的表達(dá)水平獨(dú)立于三苯氧胺的預(yù)后因素。高水平的CXXC5與野生型TP53顯著相關(guān),提示CXXC5可能代替TP53突變作為乳腺癌發(fā)生發(fā)展的致癌機(jī)制。然而目前CXXC5與卵巢癌之間的關(guān)系及其在發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制少有研究探討。本文旨在通過研究CXXC5的表達(dá)情況與卵巢癌臨床特征之間的關(guān)系及觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞系增殖、凋亡、周期、遷移、侵襲等生物學(xué)功能的影響達(dá)到提高上皮性卵巢癌預(yù)后和靶向治療的目的。方法1、GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)CXXC5在上皮性卵巢癌中的表達(dá)分析利用基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus, GEO)和腫瘤基因圖集(TheCancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫對(duì)CXXC5在上皮性卵巢癌中的表達(dá)進(jìn)行分析處理。2、CXXC5在卵巢癌及正常對(duì)照組織中的表達(dá)及臨床意義通過免疫組化方法檢測(cè)CXXC5在上皮性卵巢癌組織芯片中的表達(dá)情況并使用X2檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)方法對(duì)CXXC5與臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析。3、CXXC5在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能1)利用Lipofectamin2000TM轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEZ-Lv105-CXXC5質(zhì)粒和空載pLKO.1分別轉(zhuǎn)染OVISE卵巢癌透明細(xì)胞株和NIHOVCAR3漿液性卵巢癌細(xì)胞株,利用Lipofectamin2000TM轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEZ-Lv105-shCXXC5質(zhì)粒和空載pLKO.1分別轉(zhuǎn)染ES-2卵巢癌透明細(xì)胞株和COV504漿液性卵巢癌細(xì)胞株。2)利用RT-PCR和Western blot方法鑒定轉(zhuǎn)染后CXXC5蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。3)使用CCK8方法測(cè)定同對(duì)照組相比干擾、過表達(dá)后細(xì)胞增殖能力的改變。4)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證CCK8方法得到的結(jié)果。5)利用transwell空穿和膠穿方法檢測(cè)同對(duì)照組相比干擾、過表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。6)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)同對(duì)照組相比干擾、過表達(dá)后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化。7)通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)的角度驗(yàn)證CXXC5干擾、過表達(dá)對(duì)腫瘤增殖活性的影響。4、CXXC5可能影響卵巢癌增殖的分子學(xué)機(jī)制利用Western blot法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株CXXC5過表達(dá)和干擾前后Src,Akt,Erk1/2信號(hào)通路中相關(guān)蛋白磷酸化與非磷酸化形式。結(jié)果1、CXXC5在GEO數(shù)據(jù)庫提供的卵巢癌數(shù)據(jù)中高表達(dá),與卵巢癌進(jìn)展密切相關(guān)通過Pubmed中GEO數(shù)據(jù)庫提供的基因芯片分析了CXXC5在12對(duì)卵巢正常表面上皮細(xì)胞和卵巢癌上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與卵巢正常表面上皮細(xì)胞相比,CXXC5在卵巢癌上皮細(xì)胞中高表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(GSE14407,P=0.00159)。分析了CXXC5在小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞在早、中、晚期由癌前/非惡性向惡性/侵襲性的發(fā)展轉(zhuǎn)變。得出卵巢癌進(jìn)展密切相關(guān)(GSE24789,早期vs中期P=0.0216；早期vs晚期P=0.0281；中期vs晚期P=0.0867)。分析了CXXC5在10株卵巢癌細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXXC5在透明性卵巢癌細(xì)胞中普遍高表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(GSE3001,P=0.0186)。分析CXXC5在ER+和ER-上皮性卵巢癌中的mRNA表達(dá)情況,結(jié)果提示CXXC5在ER+的卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平(9.477±0.260)顯著高于ER-的卵巢癌細(xì)胞系表達(dá)水平(7.045±0.298),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(GSE22600,P=3.22481E-10)。2、CXXC5在TCGA數(shù)據(jù)庫提供的高級(jí)別漿液性卵巢腺癌中以擴(kuò)增為主分析TCGA數(shù)據(jù)庫中提供的489例高級(jí)別漿液性卵巢腺癌發(fā)現(xiàn)CXXC5在多種腫瘤基因組中的表達(dá)以突變和擴(kuò)增為主,而在高級(jí)別漿液性卵巢腺癌基因組中以擴(kuò)增為主。3、CXXC5在卵巢癌組織中高表達(dá)構(gòu)建了含有173例卵巢癌和37例卵巢良性囊腫樣本組織芯片,應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)CXXC5在卵巢癌組織和良性卵巢良性囊腫組織中的表達(dá)情況。CXXC5在正常卵巢對(duì)照組織中高表達(dá)率(13.5%)明顯低于在卵巢癌組織中的高表達(dá)率(39.3%)(圖3-4-2),差異有顯著性(P=0.003)。以上結(jié)果充分表明CXXC5在卵巢癌中表達(dá)顯著增高。4、CXXC5與卵巢癌組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)在173例卵巢癌組織樣本中,年齡≤50歲的有67例,高表達(dá)22例(32.8%)；年齡50歲的有106例,高表達(dá)的46例(占43.4%)；兩者之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P==0.166),提示CXXC5的高表達(dá)與卵巢癌患者的年齡無關(guān)。檢測(cè)CXXC5高表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌93例,高表達(dá)40例(43.0%),黏液性卵巢癌48例,高表達(dá)11例(23.0%),內(nèi)膜樣卵巢癌17例,高表達(dá)7例(42.2%),透明細(xì)胞卵巢癌15例,高表達(dá)10例(66.7%),四者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014),提示CXXC5的表達(dá)與卵巢癌患者的組織學(xué)類型密切相關(guān)。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有15例,高表達(dá)15例(60%)；未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有148例,高表達(dá)53例(35.8%),兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022),提示CXXC5的表達(dá)與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。按照FIGO分期中Ⅰ期74例,高表達(dá)24例(32.0%)；Ⅱ期高表達(dá)12例(42.9%);Ⅲ期高表達(dá)28例(45.2%)；Ⅳ期高表達(dá)4例(50%),四者間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.376),提示CXXC5的表達(dá)水平與卵巢癌患者的FIGO分期無關(guān)。以上結(jié)果表面CXXC5與卵巢癌組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),由此推測(cè)CXXC5可能可以作為上皮性卵巢癌組織學(xué)分類的生物學(xué)標(biāo)志物,并可能是一個(gè)提示卵巢癌的預(yù)后不良的重要標(biāo)志物。5、CXXC5促進(jìn)體內(nèi)外卵巢癌增殖活性利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),對(duì)卵巢癌細(xì)胞株進(jìn)行CXXC5過表達(dá)干擾處理以探討其生物學(xué)的功能。運(yùn)用CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示干擾CXXC5后,卵巢癌透明細(xì)胞株ES-2的增殖能力明顯減弱,在24、48、72和96小時(shí),shl組與對(duì)照組相P值分別為0.838、0.033、0.006和0.042;sh2組與對(duì)照組相比P值分別為0.018、0.0049、0.005和0.003。過表達(dá)CXXC5后,卵巢癌透明細(xì)胞株OVISE的增殖能力明顯增強(qiáng),在24、48、72和96小時(shí),過表達(dá)組與對(duì)照組相比P值分別為0.00126、2.02891E-07、6.82229E-06和6.64982E-05。利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CXXC5促進(jìn)體外卵巢癌細(xì)胞增殖活性這一結(jié)果。將干擾CXXC5的ES-2細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞分別接種到裸鼠皮下以觀察裸鼠皮下瘤增殖的能力,結(jié)果表明對(duì)照細(xì)胞組皮下瘤重量2.298±0.587 g,體積1.467±0.377 cm3,干擾細(xì)胞組皮下瘤重量為0.346±0.319 g(P=0.00054),體積為0.0445±0.0204 cm3(P=0.00105),兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反地,將過表達(dá)CXXC5的OVISE細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞分別接種到裸鼠皮下以觀察裸鼠皮下瘤增殖的能力,結(jié)果表明對(duì)照細(xì)胞組皮下瘤重量0.336±0.270 g,體積0.0422±0.0260cm3,過表達(dá)細(xì)胞組皮下瘤重量為2.192±0.754 g(P=0.00434),體積為2.194±0.833 cm3(P=0.00442),兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果證實(shí)CXXC5促進(jìn)體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞增殖活性。6、CXXC5抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)過表達(dá)和干擾CXXC5后細(xì)胞凋亡分布出現(xiàn)變化,結(jié)果表面ES-2細(xì)胞對(duì)照組凋亡率(5.007±0.342)%,CXXC5-sh1組凋亡率(8.173±1.344)%,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0478)；CXXC5-sh2組凋亡率(12.483±2.157)%,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0243)。OVISE細(xì)胞對(duì)照組凋亡率為(3.617±0.200)%,Lenti-CXXC5組凋亡率為(2.910±0.332)%,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0448)。以上結(jié)果表明,CXXC5抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。7、CXXC5對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期無誘導(dǎo)作用利用OVISE細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了過表達(dá)CXXC5的質(zhì)粒后,通過流式細(xì)胞術(shù)分析透明細(xì)胞卵巢癌系的細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果表明,對(duì)照組細(xì)胞系G0/G1期(54.300±0.167)%,S期(33.627±0.086)%,G2/M期(12.180±0.115)%；與對(duì)照組相比較,過表達(dá)組細(xì)胞系G0/G1期(51.720±0.183)%,S期(34.620±0.177)%,G2/M期(13.517±0.116)%,比例未發(fā)生明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以,CXXC5對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期無誘導(dǎo)作用。8、CXXC5增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力利用穩(wěn)定干擾CXXC5的ES-2卵巢癌透明細(xì)胞株與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行空穿實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明ES-2干擾組shl細(xì)胞數(shù)(106±16)明顯少于空載對(duì)照組細(xì)胞(259±18),P值為2.17022E-08,兩者比較差異有顯著性；ES-2干擾組sh2細(xì)胞數(shù)(102±±14)明顯少于空載對(duì)照組細(xì)胞(259±±18),P值為1.58984E-08,兩者比較差異有顯著性。利用穩(wěn)定干擾CXXC5的ES-2卵巢癌透明細(xì)胞株與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行膠穿實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明ES-2干擾組shl細(xì)胞數(shù)(9±2)明顯少于空載對(duì)照組細(xì)胞(20±±4),P值為0.0030；兩者比較差異有顯著性；ES-2干擾組sh2細(xì)胞數(shù)(6±1)明顯少于空載對(duì)照組細(xì)胞(20±±4),P值為0.0012,兩者比較差異有顯著性。上述結(jié)果充分說明CXXC5具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系的體外遷移和侵襲的能力。9、CXXC5激活Src,Akt,Erk1/2信號(hào)通路基于上述研究結(jié)果,進(jìn)一步探討了CXXC5調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡的分子機(jī)制。利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)CXXC5對(duì)Src,Akt,Erkl/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。干擾CXXC5后Akt,Src,FAK和Erk/2的磷酸化蛋白水平顯著降低,而總的蛋白水平維持不變。相反地,過表達(dá)CXXC5后Akt,Src,FAK和Erkl/2的磷酸化蛋白水平顯著增加,而總的蛋白水平維持不變。以上結(jié)果充分說明CXXC5通過激活Src,Akt,Erk1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡。結(jié)論1、CXXC5可能是一個(gè)上皮性卵巢癌的預(yù)后不良的重要標(biāo)志物。2、CXXC5能在體內(nèi)外促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖活性。3、CXXC5能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力；抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。4、CXXC5可能通過激活Src, Akt, Erk1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1187098