本文關鍵詞：肺腺癌及癌旁組織差異轉錄因子的初步分析研究

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【摘要】：目的:使用catTFRE(a concatenated tandem array of the consensus transcription factor response elements)對30例肺腺癌及癌旁組織中的轉錄因子進行富集和定量描繪,尋找癌組織與癌旁組織中差異表達的轉錄因子,并初步探討這些差異轉錄因子參與的生物過程、調(diào)控的信號通路等。方法:catTFRE是利用轉錄因子與序列特異性DNA序列結合的特點,設計合成的串聯(lián)各種轉錄因子的多拷貝雙鏈DNA結合元件,然后通過分子克隆技術聚合酶鏈式反應(PCR)在DNA序列兩端各加入生物素(Biotin)標記的引物,形成“DNA誘餌”,然后將PCR的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離出目標條帶,回收目的條帶中生物素化的DNA(Biotin-DNA),再將純化好Biotin-DNA偶聯(lián)到鏈霉親和素包被的磁珠(Dynal M280)上;提取肺腺癌及癌旁組織的核蛋白,然后與Biotin-DNA-磁珠一起孵育,孵育過程中轉錄因子與序列DNA特異性結合,經(jīng)過洗滌后從核蛋白中分離純化轉錄因子及其復合物。最后,經(jīng)過一維的濃度為10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%SDS-PAGE)對富集的樣品進行預分離,進行膠內(nèi)酶解、肽段萃取,并將每組樣品分為3個組份,經(jīng)60℃真空抽干,得到可以進行質(zhì)譜分析的肽段樣品,進一步進行轉錄因子的質(zhì)譜鑒定。得到質(zhì)譜鑒定結果之后,應用基于強度的絕對定量方法(Intensity based absolute quantification,or iBAQ),依據(jù)癌組織與癌旁組織的iBAQ值之間的比值對蛋白的表達量進行評定,尋找表達差異的轉錄因子。對于差異的轉錄因子,通過基因本體(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)及蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions,PPI)進行生物信息學分析,探討這些差異轉錄因子所參與的一些生物過程、調(diào)控的信號通路及蛋白相互作用網(wǎng)絡。結果:肺腺癌質(zhì)譜鑒定結果為:質(zhì)譜掃描譜圖的平均利用率50%,通過數(shù)據(jù)庫搜索,得到高可信度肽段數(shù)7340-10527,平均高可信度肽段數(shù)9841;鑒定到蛋白數(shù)為1420-2512,平均蛋白數(shù)1863種(特異性肽段數(shù)量≥1),含有123-330種轉錄因子,平均184種;癌旁組織質(zhì)譜鑒定結果為:質(zhì)譜掃描譜圖的平均利用率50%,通過數(shù)據(jù)庫搜索,得到高可信度肽段數(shù)6918-9588,平均高可信度肽段數(shù)8390;鑒定到蛋白數(shù)1389-2478,平均蛋白數(shù)1688種(特異性肽段數(shù)量≥1),含有112-278種轉錄因子,平均162種癌組織與癌旁組織之間差異表達轉錄因子上調(diào)的有154種,下調(diào)的86種。差異表達轉錄因子在GO中的富集分析(生物過程)主要包括:1.RNA生物合成過程的調(diào)控;2.RNA代謝過程的調(diào)控;3.細胞大分子生物合成過程的調(diào)控;4.轉錄調(diào)控、DNA模板;5.大分子生物合成過程的調(diào)控;6.RNA生物合成的過程;7.聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄;8.細胞生物合成過程的調(diào)控;9.生物合成過程的調(diào)控;10.基因表達的調(diào)控。以及細胞分化、組織發(fā)育、細胞分化的調(diào)控、上皮發(fā)育、細胞增殖的調(diào)控、細胞凋亡、細胞凋亡的調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控等。KEGG對差異表達轉錄因子調(diào)節(jié)的信號通路富集主要包括:1.癌癥轉錄失調(diào);2.乙型肝炎;3.癌癥途徑;4.甲狀腺癌;5.急性髓細胞樣白血病;6.人類嗜T細胞病毒感染;7.破骨細胞分化;8.前列腺癌;9.病毒致癌;10.Wnt信號通路。以及非小細胞肺癌、腫瘤壞死因子信號通路、小細胞肺癌、細胞周期等。PPI分析差異表達轉錄因子發(fā)現(xiàn)轉錄因子JUN在蛋白-蛋白相關作用的網(wǎng)絡中,處于與一個“核心(hub)”的位置,可以與多個轉錄因子相互作用,參與調(diào)節(jié)多種信號通路。結論:catTFRE可以高效富集肺腺癌及癌旁組織的轉錄因子,并對差異表達的轉錄因子做了GO、KEGG及PPI生物信息學分析,探討了這些差異轉錄因子所參與的一些生物過程、調(diào)控的信號通路及蛋白相互作用網(wǎng)絡中處于“核心(hub)”位置的轉錄因子JUN,為未來對肺腺癌的深入研究提供一些可資借鑒的數(shù)據(jù),有助于解釋轉錄因子與肺腺癌發(fā)生發(fā)展之間的關系,有助于更加完整、真實地揭示肺腺癌的發(fā)病機制。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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