本文關(guān)鍵詞：GPER介導他莫昔芬對人乳腺癌相關(guān)成纖維細胞的增殖、遷移及凋亡作用

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【摘要】：目的：通過構(gòu)建G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)的慢病毒短發(fā)夾RNA(shRNA)表達載體,探討GPER介導他莫昔芬(tamoxifen, TAM)對人乳腺癌相關(guān)成纖維細胞(Cancer-associated fibroblast, CAF)的細胞增殖、遷移與凋亡作用1。方法：1.設(shè)計4條長度為19 bp的針對GPER基因shRNA的寡核苷酸序列及陰性對照序列,合成相應(yīng)的siRNA序列。將GV1 15載體用AgeⅠ和EcoR I行雙酶切,將酶切產(chǎn)物和合成的成對的寡鏈氨基酸退火形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)混合,通過T4 DNA連接酶連接,用大腸桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化后挑取轉(zhuǎn)化子,使用GV115載體通用引物,進行菌落PCR及測序鑒定,在HEK293T細胞中包裝病毒及測定病毒滴度。通過實時定量PCR進行內(nèi)源性篩靶,選取干擾效果最佳的病毒進行后續(xù)實驗,Western blot法檢測慢病毒在靶細胞的蛋白表達。2.將CAF細胞分為4組,NC(negative control,NC)組、GPER-RNAi、NC聯(lián)合TAM組和GPER-RNAi聯(lián)合TAM組,CCK-8檢測法、流式細胞術(shù)及Transwell實驗檢測經(jīng)他莫昔芬處理后各組CAF細胞的增殖、遷移及凋亡能力。結(jié)果：1.Lenti-GPER-siRNA慢病毒載體經(jīng)HEK293T細胞包裝成功,Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入病毒后GPER在CAF細胞中的表達較NC組顯著降低(P0.05)。2.流式細胞術(shù)及CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況。各組PI分別為(30.76±7.4)%,(32.54±3.5)%,(43.61±4.4)%(P=0),(34.93±6.8)%。TAM處理72h后,NC聯(lián)合TAM組細胞數(shù)增加至NC組的(172.16±10.8)%(P=0)。GPER-RNAi組細胞數(shù)為NC組的(92.73±7.1%(P=0.10),GPER-RNAi聯(lián)合TAM組(96.58±4.2)%(P=0.43)。流式細胞術(shù)檢測NC組、GPER-RNAi組、NC聯(lián)合TAM組和GPER-RNAi聯(lián)合NC組細胞凋亡比率分別為：(29.10±1.4)%、(28.27±1.3)%、(9.62±0.91)%、(31.09±1.2)%。GPER-RNAi組細胞凋亡比率與NC組無明顯差異P0.05,。NC聯(lián)合TAM組凋亡低于對照組(P0.05)。Transwell實驗提示加入TAM后,CAF遷移細胞數(shù)明顯增加(遷移細胞數(shù)由40.75±3.59個增加至99.50±4.80個),而GPER-RNAi聯(lián)合TAM組則無明顯變化。結(jié)論成功構(gòu)建Lenti-GPER-siRNA慢病毒載體,感染CAF后可有效沉默GPER表達；TAM通過GPER促進CAF細胞增殖并抑制其細胞凋亡。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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本文編號：1177707