本文關鍵詞：原發(fā)性肝癌中B7-H4的高表達對T細胞免疫抑制的研究

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【摘要】：背景及目的:原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)是我國常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中高居第3位,具有發(fā)病隱匿、進展迅速、治療困難、死亡率高等特點,成為世界范圍內(nèi)惡性腫瘤高發(fā)病率和死亡率的主要因素,當前治療原發(fā)性肝癌的方式主要是以手術切除為主,結合術前或術后放化療,微創(chuàng)治療及生物治療的模式。隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展及對腫瘤研究的不斷深入,惡性腫瘤的免疫靶向治療方式成為目前研究的熱點,其中T細胞免疫和B7家族中負性共刺激分子B7-H4在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中的免疫應答越來越受到重視。在腫瘤免疫應答過程中T細胞介導的細胞免疫起關鍵作用,T淋巴細胞活化及抗原特異性T細胞免疫應答的產(chǎn)生及維持至少需要2個信號:第一信號由位于抗原提呈細胞(APC)上的抗原肽-組織相容性抗原(MHC)與T細胞表面的受體(TCR)相互識別作用產(chǎn)生;第二信號由位于APC上的刺激分子與T細胞上相對應的受體結合產(chǎn)生,又稱協(xié)同共刺激信號。共刺激信號傳導途徑一方面增強T細胞免疫應答過程中的正性第二信號,另一方面下調(diào)T細胞免疫應答過程中的負性第二信號,在缺少TCR第二信號的情況下,會導致T淋巴細胞克隆無能或抑制T淋巴細胞的活化與功能,最終導致免疫抑制及免疫逃逸。負性共刺激分子B7-H4屬于B7免疫球蛋白超家族,目前研究表明在腫瘤中B7-H4對T細胞免疫應答具有顯著的負性調(diào)節(jié)作用,目前是腫瘤免疫治療的研究熱點。對于該課題,我們課題組前期已經(jīng)作了一些相關研究并取得一定成果:(1)采用免疫熒光技術對80例人原發(fā)性肝癌和癌旁組織,20例正常肝組織中B7-H4的表達進行相關檢測。統(tǒng)計學分析結果表明:人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4的表達顯著高于肝癌旁組織和正常肝組織。(2)采用熒光免疫組化染色檢測80例人肝癌組織中B7-H4的表達與CD4+T、CD8+T細胞浸潤程度及功能性細胞因子TGF-β1、IFN-γ分泌相關性。統(tǒng)計學分析結果表明:人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4的表達水平與肝癌內(nèi)CD4+T,CD8+T淋巴細胞浸潤程度,功能性細胞因子TGF-β1和IFN-γ分泌均呈負相關。(3)采用Western Blot技術檢測人原發(fā)性肝癌及癌旁組織中純化分離出CD8+T細胞中B7-H4,IFN-γ及自噬上游信號通路PI3K-AKT-m TOR相關蛋白的表達情況。結果表明:與癌旁組織相比,肝癌組織純化分離出CD8+T細胞中B7-H4表達明顯上調(diào),細胞因子IFN-γ表達明顯下降;CD8+T細胞中P-AKT/AKT,P-m TOR/m TOR比值上升。提示原發(fā)性肝癌組織CD8+T中B7-H4表達上調(diào)可能通過PI3K/AKT/m TOR信號通路促進CD8+T細胞發(fā)生異常自噬。結合前期實驗結果,本次實驗主要檢測從人原發(fā)性肝癌及癌旁組織中純化分離出CD8+T細胞中的自噬下游信號通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相關蛋白及ATG7 m RNA、LC3II m RNA的表達情況,探討人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4高表達對T細胞免疫抑制的影響。方法:本次實驗首先采用免疫磁珠分選技術從同一來源的新鮮人原發(fā)性肝癌組織及癌旁組織中純化分離出CD8+T細胞,一方面利用Western Blot技術分別檢測兩組CD8+T細胞中自噬下游信號通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相關蛋白的表達情況;另一方面利用熒光定量PCR技術分別檢測兩組CD8+T細胞中ATG7及自噬標志性蛋白LC3II的m RNA表達情況。應用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,采用的統(tǒng)計方法為:兩樣本的t檢驗,在P0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。從而探討人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4高表達對T細胞免疫抑制的影響。結果:(1)自噬相關蛋白LC3I在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯低于癌旁組織,差別具有統(tǒng)計學意義(t=6.72,P=0.001)。(2)自噬標志性蛋白LC3II在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織,差別具有統(tǒng)計學意義(t=6.68,P=0.001)。(3)自噬相關蛋白ATG7在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織,差別具有統(tǒng)計學意義(t=4.49,P=0.004)。(4)自噬相關蛋白ATG5-ATG12在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織,差別具有統(tǒng)計學意義(t=4.72,P=0.003)。(5)ATG7 m RNA在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織,差別具有統(tǒng)計學意義(t,=4.14,P=0.025)。(6)LC3II m RNA在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織,差別具有統(tǒng)計學意義(t=4.29,P=0.005)。結論:自噬下游信號通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3II相關蛋白的表達在原發(fā)性肝癌組織CD8+T細胞中明顯高于癌旁組織,自噬相關蛋白LC3I的表達在原發(fā)性肝癌組織CD8+T細胞中明顯低于癌旁組織;同時,ATG7及LC3II的m RNA的表達在原發(fā)性肝癌組織CD8+T細胞中明顯高于癌旁組織,與其蛋白的表達趨勢一致,結合實驗結果我們可以推論人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4的高表達,導致CD8+T細胞中PI3K-AKT-m TOR信號通路的激活,進而激活下游自噬相關因子,使CD8+T細胞發(fā)生異常自噬,抑制T細胞的免疫功能,降低了T細胞的抗腫瘤效應,使腫瘤產(chǎn)生免疫抑制和免疫逃逸的現(xiàn)象。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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