本文關(guān)鍵詞：GP73單克隆抗體的制備、鑒定及免疫檢測方法的建立與應(yīng)用研究

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【摘要】：目的肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前世界范圍內(nèi)位居第5位的致死性惡性腫瘤,也是近年來發(fā)病率上升最快的腫瘤之一。我國是肝癌的高發(fā)區(qū),全球每年新發(fā)肝癌病例約56萬,我國占1/2以上。目前HCC的常規(guī)篩查和診斷方法包括體格檢查、影像學檢查及血清甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)檢測。AFP雖為診斷HCC的首選指標,但其敏感性和特異性均不理想。血清高爾基體蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新型HCC血清標志物。為評估GP73作為肝癌血清標志物的臨床應(yīng)用價值,本研究制備并鑒定了2株抗GP73重組蛋白的單克隆抗體(mAb),并應(yīng)用該抗體建立了雙抗體夾心ELISA(enzyme-linked immunoassay)方法用于人血清GP73的定量檢測,進一步建立了基于GP73單克隆抗體的磁分離酶聯(lián)免疫檢測方法(magnetic enzyme-linked immunoassay,MEIA),并進行了初步評價。方法1.制備和純化了GP73融合蛋白以及一對抗GP73的單克隆抗體(a-GP73mAb)。以SDS-PAGE電泳鑒定了GP73融合蛋白;以間接ELISA法檢測抗體效價;并進行了抗體亞類鑒定;以Western blot及免疫組織化學鑒定抗體特異性。2.以a-GP73 mAb 8E7作為包被抗體包被96孔板,以HRP標記的a-GP73mAb 5A10作為檢測抗體,通過棋盤滴定法確定最適工作濃度及反應(yīng)條件;以純化的GP73抗原為標準品建立標準曲線,建立雙抗體夾心ELISA法,并應(yīng)用新建立的ELISA方法測定103例正常人及119例肝癌患者的血清GP73含量。3.以a-gp73mab8e7作為包被抗體包被磁性顆粒,以hrp標記的a-gp73mab5a10作為檢測抗體,確定其最佳工作濃度及反應(yīng)條件后,以純化的gp73抗原為標準品建立標準曲線,建立meia方法,并應(yīng)用該方法對正常人、肝癌患者血清中的gp73含量進行了初步檢測。結(jié)果1.成功制備并純化了gp73蛋白,并以sds-page電泳進行了鑒定,其純度高達90%。成功制備并純化了兩株抗體,分別命名為5a10和8e7,其免疫球蛋白亞類重鏈分別為igg1、igg2a,每株抗體效價均達1:243,000以上,westernblot和免疫組織化學結(jié)果顯示,抗人gp73單克隆抗體能與gp73特異性結(jié)合。2.成功建立了可定量檢測血清gp73含量的雙抗體夾心elisa方法,該方法的最低檢測限為1.56ng/ml。利用此法定量測定了103例正常人和119例肝癌患者血清,結(jié)果顯示中肝癌組較正常對照組gp73含量明顯升高(p0.05)。3.成功建立了meia方法,此法通過增加免疫磁珠量可使最低檢測限達到0.78ng/ml或更低。利用此法初步測定了正常人和肝癌患者的血清gp73,其血清檢測結(jié)果跟雙抗夾心elisa方法檢測出來的結(jié)果一致,但與雙抗體夾心elisa方法相比,磁酶免方法更便捷、省時。結(jié)論本研究成功誘導表達與純化了gp73融合蛋白,以該融合蛋白為免疫原,成功制備及純化得到2株高效價的抗人gp73mab,應(yīng)用制備的gp73單抗建立了雙抗體夾心elisa法和磁酶免方法,以此兩種免疫方法檢測了正常人和肝癌血清樣本中g(shù)p73含量,結(jié)果表明肝癌患者血清gp73水平較正常人異常升高。進一步對兩種免疫方法進行了檢測性能評估,表明磁酶免方法比雙抗體夾心elisa法更高效、便捷以及省時。我們的研究提示gp73分子在肝癌診斷中具有預(yù)警價值,有望成為肝癌早期診斷標志物,建立的基于gp73單抗的免疫檢測方法未來有望在肝癌的臨床檢測、疾病篩查中進一步的推廣應(yīng)用。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7;R730.43

【參考文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 沈鵬;異常凝血酶DCP單克隆抗體的制備及鑒定[D];南京醫(yī)科大學;2014年

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本文編號：1137262