本文關(guān)鍵詞：IL-6抑制單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞CCR7表達(dá)的機(jī)制研究

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【摘要】：一、研究背景DCs在調(diào)節(jié)人體免疫平衡、清除感染、對抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用。近年來隨著對腫瘤認(rèn)識(shí)不斷深入,腫瘤免疫逃逸被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。而樹突狀細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸之間的關(guān)系是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。功能成熟的樹突狀細(xì)胞在攝取腫瘤抗原后可以激活CD8+T細(xì)胞,進(jìn)而清除腫瘤細(xì)胞。在這個(gè)過程中,DCs需要高表達(dá)共刺激分子(CD86、CD80、CD83、CD40等),MHC-I類和MHC-II分子以及趨化因子受體7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)。共刺激分子與MHC類分子是DCs抗原提呈和激活T細(xì)胞的關(guān)鍵分子,缺少了它們的表達(dá),T細(xì)胞就不能被有效激活。CCR7則是介導(dǎo)DCs遷移功能的最重要的趨化因子受體。在人體內(nèi),DCs廣泛分布于人體淋巴器官和外周非淋巴組織(肝臟、皮膚、腎臟、胃腸等),而一旦被刺激成熟后,DCs上調(diào)表達(dá)CCR7,而CCR7在與配體CCL19或者CCL21結(jié)合后,介導(dǎo)成熟DCs沿輸入淋巴管遷移到淋巴器官并通過共刺激分子和MHC類分子激活T細(xì)胞。所以DCs的遷移運(yùn)動(dòng)能力和刺激T細(xì)胞的能力都是激活特異性免疫的關(guān)鍵因素。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期,樹突狀細(xì)胞通常能夠有效激活T細(xì)胞去殺傷腫瘤細(xì)胞。但是隨著腫瘤進(jìn)一步發(fā)展,樹突狀細(xì)胞往往處于失能狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞通過與其他基質(zhì)細(xì)胞相互作用、分泌免疫抑制因子等機(jī)制改變自身生存環(huán)境,形成具有促腫瘤生長、抑制免疫反應(yīng)特點(diǎn)的腫瘤微環(huán)境(tumour microenvironment,TME)。而在腫瘤微環(huán)境中,樹突狀細(xì)胞的分化成熟和遷移能力被抑制的。在正常生理情況下,IL-6對樹突狀細(xì)胞生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要作用,但是腫瘤微環(huán)境中高水平的免疫抑制因子IL-6(interleukin-6)被證實(shí)是抑制樹突狀細(xì)胞分化成熟和遷移能力的重要因子。在腫瘤微環(huán)境中,IL-6能抑制DCs共刺激分子和MHC類分子的表達(dá),并且抑制CD34+前體細(xì)胞向DCs分化。在腫瘤微環(huán)境中樹突狀細(xì)胞通常低表達(dá)CCR7,而高表達(dá)CCR6、CCR2、CCR1、CCR5、CXCR4分子。而后者通常在不成熟樹突狀細(xì)胞和免疫耐受樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)。而不成熟樹突狀細(xì)胞和免疫耐受樹突狀細(xì)胞都是具有免疫抑制性質(zhì)的。CCR7表達(dá)的缺失被證實(shí)會(huì)導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞遷移障礙,最終導(dǎo)致機(jī)體免疫缺陷。最近有學(xué)者報(bào)道腫瘤細(xì)胞來源的il-6明顯抑制人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(humanmonocyte-deriveddendriticcells,modcs)ccr7的表達(dá)和modcs的遷移能力,但其內(nèi)在分子機(jī)制還不清楚。在某些類型的腫瘤組織(宮頸癌)中腫瘤基質(zhì)里的樹突狀細(xì)胞高表達(dá)其成熟標(biāo)志cd83,但是低表達(dá)或不表達(dá)ccr7。所以il-6通過抑制樹突狀細(xì)胞ccr7表達(dá)而阻止dcs向淋巴器官遷移,可能是導(dǎo)致腫瘤宿主免疫缺陷的原因之一。所以我們希望通過研究il-6抑制modcsccr7表達(dá)的內(nèi)在分子機(jī)制,找到能夠糾正modcs遷移功能障礙的分子靶點(diǎn),為糾正腫瘤患者的免疫缺陷提供新的策略。二、研究方法1、采用磁珠分選(magnetic-activatedcellsorting,macs)法從人外周血中分選出cd14+單核細(xì)胞,使用含青鏈雙抗的10%rpmi-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為5%co2、37℃。并補(bǔ)充細(xì)胞因子rhgm-csf800u/ml、rhil-4500u/ml進(jìn)行modcs的誘導(dǎo)分化。細(xì)胞每隔兩天半量更換培養(yǎng)基,并補(bǔ)充丟失的rhil-4,rhgm-csf。在培養(yǎng)的第3天,加入不同劑量的il-6,使其終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml。在培養(yǎng)第6天,加入lps(100ng/ml)刺激48h后,收獲modcs,流式分析檢測cd86、cd83以及hla-dr的表達(dá)水平。定量rt-pcr檢測ccr7mrna的表達(dá)。2、在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,擬對il-6抑制modcsccr7表達(dá)的分子機(jī)制進(jìn)行研究。由于il-6有兩條關(guān)鍵的下游信號通路:gp130tyr759-shp-2/erk信號通路和gp130yxxq-jak/stat3信號通路,所以我們通過westernblotting檢測il-6處理的modcs細(xì)胞內(nèi)p-stat3和p-erk1/2的表達(dá)情況。3、在第二部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們使用了p-stat3抑制劑jsi-124與p-erk1/2抑制劑pd98059分別抑制il-6處理后modcs細(xì)胞內(nèi)p-stat3和p-erk1/2的表達(dá)。定量rt-pcr分別檢測jsi-124與pd98059對il-6抑制modcsccr7mrna表達(dá)的影響。流式分析檢測jsi-124對il-6抑制modcsccr7表達(dá)的影響。transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測jsi-124對il-6抑制modcs遷移的影響。三、研究結(jié)果1、通過rhgm-csf、rhil-4聯(lián)合誘導(dǎo)法,培養(yǎng)得到具有典型樹突形態(tài)的人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞。lps刺激獲得成熟的樹突狀細(xì)胞。流式分析發(fā)現(xiàn),終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6對modcs的表型成熟分子:cd86、cd83、hla-dr的表達(dá)沒有抑制作用。il-6(50ng/ml)+lps組dc86/dc83/hla-dr表達(dá)率分別為90.1±1.2、81.2±1.5、94.6±1.8。il-6(100ng/ml)+lps組dc86/dc83/hla-dr表達(dá)率分別為96.2±1.6、86.9±0.9、87.7±1.3。il-6(150ng/ml)+lps組dc86/dc83/hla-dr表達(dá)率分別為91.3±1.2、91.0±1.6、87.0±1.7。與lps單獨(dú)處理組(lps組dc86/dc83/hla-dr表達(dá)率分別為92.6±1.7、82.0±1.2、93.4±1.4)相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。而定量rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6能明顯抑制modcsccr7mrna的表達(dá)(ccr7mrna的相對表達(dá)量依次為0.760±0.079、0.440±0.029、0.435±0.059),并與lps單獨(dú)處理組(1.246±0.102)相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(p0.05)。2、westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)il-6處理組modcsp-stat3、p-erk1/2的表達(dá)明顯高于lps單獨(dú)處理組。終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6處理組p-stat3的相對表達(dá)量依次為:1.240±0.092、1.438±0.105、1.875±0.127,與lps單獨(dú)處理組(0.724±0.086)相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6處理組p-erk的相對表達(dá)量依次為:1.085±0.067、1.071±0.082、0.856±0.039,與lps單獨(dú)處理組(0.359±0.024)相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。3、westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124和pd98059能分別抑制il-6導(dǎo)致的p-stat3和p-erk1/2過度活化。il-6(100ng/ml)+jsi-124組p-stat3相對表達(dá)量為0.841±0.018,低于il-6(100ng/ml)單獨(dú)處理組(1.388±0.090)(p0.05)。il-6(100ng/ml)+pd98059組p-erk相對表達(dá)量為0.389±0.076,低于il-6100ng/ml單獨(dú)處理組(0.688±0.082)(p0.05)。定量rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124能逆轉(zhuǎn)il-6對modcsccr7mrna的表達(dá),il-6(100ng/ml)+jsi-124+lps組moccr7mrna相對表達(dá)量為0.640±0.101,明顯高于il-6(100ng/ml)+lps組(0.219±0.018)(p0.05)。pd98059卻不能。il-6(100ng/ml)+pd98059+lps組moccr7mrna相對表達(dá)量為0.260±0.038,與il-6(100ng/ml)+lps組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。流式分析檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124能逆轉(zhuǎn)il-6對modcsccr7表達(dá)的抑制,il-6(100ng/ml)+jsi-124+lps組modcsccr7表達(dá)率為83.0±1.2,明顯高于il-6(100ng/ml)+lps組(15.4±0.9)(p0.05)。transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124還能逆轉(zhuǎn)il-6對modcs遷移的抑制,il-6(100ng/ml)+JSI-124+LPS組moDCs的遷移率為74.5±3.3,明顯高于IL-6(100ng/ml)+LPS組(26.2±2.1)(P0.05)。四、研究結(jié)論1、IL-6對moDCs的表型成熟分子DC86、DC83、HLA-DR的表達(dá)沒有抑制作用,而對moDCsCCR7mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用。2、IL-6能明顯激活moDCs內(nèi)STAT3信號通路和ERK信號通路。3、JSI-124抑制p-STAT3表達(dá)后,能逆轉(zhuǎn)IL-6對moDCs CCR7mRNA表達(dá)的抑制,而p-ERK抑制劑PD98059卻不能。而且JSI-124還能逆轉(zhuǎn)IL-6對moDCsCCR7表達(dá)和遷移能力的抑制。結(jié)果提示IL-6通過STAT3信號通路,而不通過ERK信號通路抑制moDCsCCR7的表達(dá)和細(xì)胞遷移能力。STAT3可能成為干預(yù)moDCs遷移障礙的分子靶點(diǎn),為糾正腫瘤患者的免疫缺陷提供理論支撐。
【關(guān)鍵詞】：IL-6 人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 腫瘤微環(huán)境 細(xì)胞趨化因子受體7 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.3
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-17
• 第二章 體外建立IL-6 抑制人外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞CCR7表達(dá)模型17-34
• 2.1 材料和方法17-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-30
• 2.3 討論30-33
• 2.4 小結(jié)33-34
• 第三章 IL-6 對單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞內(nèi)STAT3信號通路和ERK信號通路的影響34-43
• 3.1 材料和方法34-38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-40
• 3.3 討論40-42
• 3.4 小結(jié)42-43
• 第四章 STAT3信號通路和ERK信號通路在IL-6 抑制人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞CCR7表達(dá)中的作用43-60
• 4.1 材料和方法43-53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-57
• 4.3 討論57-59
• 4.4 小結(jié)59-60
• 全文結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 文獻(xiàn)綜述 腫瘤微環(huán)境中IL-6 與樹突狀細(xì)胞的研究進(jìn)展66-74
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 碩士期間發(fā)表的論文74-75
• 致謝75

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