發(fā)布時間：2017-10-29 18:22

  本文關鍵詞：IL-6抑制單核細胞來源樹突狀細胞CCR7表達的機制研究

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【摘要】：一、研究背景DCs在調節(jié)人體免疫平衡、清除感染、對抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用。近年來隨著對腫瘤認識不斷深入,腫瘤免疫逃逸被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。而樹突狀細胞與腫瘤免疫逃逸之間的關系是當前研究的熱點。功能成熟的樹突狀細胞在攝取腫瘤抗原后可以激活CD8+T細胞,進而清除腫瘤細胞。在這個過程中,DCs需要高表達共刺激分子(CD86、CD80、CD83、CD40等),MHC-I類和MHC-II分子以及趨化因子受體7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)。共刺激分子與MHC類分子是DCs抗原提呈和激活T細胞的關鍵分子,缺少了它們的表達,T細胞就不能被有效激活。CCR7則是介導DCs遷移功能的最重要的趨化因子受體。在人體內,DCs廣泛分布于人體淋巴器官和外周非淋巴組織(肝臟、皮膚、腎臟、胃腸等),而一旦被刺激成熟后,DCs上調表達CCR7,而CCR7在與配體CCL19或者CCL21結合后,介導成熟DCs沿輸入淋巴管遷移到淋巴器官并通過共刺激分子和MHC類分子激活T細胞。所以DCs的遷移運動能力和刺激T細胞的能力都是激活特異性免疫的關鍵因素。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期,樹突狀細胞通常能夠有效激活T細胞去殺傷腫瘤細胞。但是隨著腫瘤進一步發(fā)展,樹突狀細胞往往處于失能狀態(tài)。腫瘤細胞通過與其他基質細胞相互作用、分泌免疫抑制因子等機制改變自身生存環(huán)境,形成具有促腫瘤生長、抑制免疫反應特點的腫瘤微環(huán)境(tumour microenvironment,TME)。而在腫瘤微環(huán)境中,樹突狀細胞的分化成熟和遷移能力被抑制的。在正常生理情況下,IL-6對樹突狀細胞生物學功能的發(fā)揮具有重要作用,但是腫瘤微環(huán)境中高水平的免疫抑制因子IL-6(interleukin-6)被證實是抑制樹突狀細胞分化成熟和遷移能力的重要因子。在腫瘤微環(huán)境中,IL-6能抑制DCs共刺激分子和MHC類分子的表達,并且抑制CD34+前體細胞向DCs分化。在腫瘤微環(huán)境中樹突狀細胞通常低表達CCR7,而高表達CCR6、CCR2、CCR1、CCR5、CXCR4分子。而后者通常在不成熟樹突狀細胞和免疫耐受樹突狀細胞表面表達。而不成熟樹突狀細胞和免疫耐受樹突狀細胞都是具有免疫抑制性質的。CCR7表達的缺失被證實會導致樹突狀細胞遷移障礙,最終導致機體免疫缺陷。最近有學者報道腫瘤細胞來源的il-6明顯抑制人單核細胞來源的樹突狀細胞(humanmonocyte-deriveddendriticcells,modcs)ccr7的表達和modcs的遷移能力,但其內在分子機制還不清楚。在某些類型的腫瘤組織(宮頸癌)中腫瘤基質里的樹突狀細胞高表達其成熟標志cd83,但是低表達或不表達ccr7。所以il-6通過抑制樹突狀細胞ccr7表達而阻止dcs向淋巴器官遷移,可能是導致腫瘤宿主免疫缺陷的原因之一。所以我們希望通過研究il-6抑制modcsccr7表達的內在分子機制,找到能夠糾正modcs遷移功能障礙的分子靶點,為糾正腫瘤患者的免疫缺陷提供新的策略。二、研究方法1、采用磁珠分選(magnetic-activatedcellsorting,macs)法從人外周血中分選出cd14+單核細胞,使用含青鏈雙抗的10%rpmi-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為5%co2、37℃。并補充細胞因子rhgm-csf800u/ml、rhil-4500u/ml進行modcs的誘導分化。細胞每隔兩天半量更換培養(yǎng)基,并補充丟失的rhil-4,rhgm-csf。在培養(yǎng)的第3天,加入不同劑量的il-6,使其終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml。在培養(yǎng)第6天,加入lps(100ng/ml)刺激48h后,收獲modcs,流式分析檢測cd86、cd83以及hla-dr的表達水平。定量rt-pcr檢測ccr7mrna的表達。2、在第一部分實驗的基礎上,擬對il-6抑制modcsccr7表達的分子機制進行研究。由于il-6有兩條關鍵的下游信號通路:gp130tyr759-shp-2/erk信號通路和gp130yxxq-jak/stat3信號通路,所以我們通過westernblotting檢測il-6處理的modcs細胞內p-stat3和p-erk1/2的表達情況。3、在第二部分實驗的基礎上,我們使用了p-stat3抑制劑jsi-124與p-erk1/2抑制劑pd98059分別抑制il-6處理后modcs細胞內p-stat3和p-erk1/2的表達。定量rt-pcr分別檢測jsi-124與pd98059對il-6抑制modcsccr7mrna表達的影響。流式分析檢測jsi-124對il-6抑制modcsccr7表達的影響。transwell細胞遷移實驗檢測jsi-124對il-6抑制modcs遷移的影響。三、研究結果1、通過rhgm-csf、rhil-4聯(lián)合誘導法,培養(yǎng)得到具有典型樹突形態(tài)的人單核細胞來源樹突狀細胞。lps刺激獲得成熟的樹突狀細胞。流式分析發(fā)現(xiàn),終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6對modcs的表型成熟分子:cd86、cd83、hla-dr的表達沒有抑制作用。il-6(50ng/ml)+lps組dc86/dc83/hla-dr表達率分別為90.1±1.2、81.2±1.5、94.6±1.8。il-6(100ng/ml)+lps組dc86/dc83/hla-dr表達率分別為96.2±1.6、86.9±0.9、87.7±1.3。il-6(150ng/ml)+lps組dc86/dc83/hla-dr表達率分別為91.3±1.2、91.0±1.6、87.0±1.7。與lps單獨處理組(lps組dc86/dc83/hla-dr表達率分別為92.6±1.7、82.0±1.2、93.4±1.4)相比較無統(tǒng)計學差異(p0.05)。而定量rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6能明顯抑制modcsccr7mrna的表達(ccr7mrna的相對表達量依次為0.760±0.079、0.440±0.029、0.435±0.059),并與lps單獨處理組(1.246±0.102)相比較有統(tǒng)計學差異。(p0.05)。2、westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)il-6處理組modcsp-stat3、p-erk1/2的表達明顯高于lps單獨處理組。終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6處理組p-stat3的相對表達量依次為:1.240±0.092、1.438±0.105、1.875±0.127,與lps單獨處理組(0.724±0.086)相比較有統(tǒng)計學差異(p0.05)。終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的il-6處理組p-erk的相對表達量依次為:1.085±0.067、1.071±0.082、0.856±0.039,與lps單獨處理組(0.359±0.024)相比較有統(tǒng)計學差異(p0.05)。3、westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124和pd98059能分別抑制il-6導致的p-stat3和p-erk1/2過度活化。il-6(100ng/ml)+jsi-124組p-stat3相對表達量為0.841±0.018,低于il-6(100ng/ml)單獨處理組(1.388±0.090)(p0.05)。il-6(100ng/ml)+pd98059組p-erk相對表達量為0.389±0.076,低于il-6100ng/ml單獨處理組(0.688±0.082)(p0.05)。定量rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124能逆轉il-6對modcsccr7mrna的表達,il-6(100ng/ml)+jsi-124+lps組moccr7mrna相對表達量為0.640±0.101,明顯高于il-6(100ng/ml)+lps組(0.219±0.018)(p0.05)。pd98059卻不能。il-6(100ng/ml)+pd98059+lps組moccr7mrna相對表達量為0.260±0.038,與il-6(100ng/ml)+lps組相比較無統(tǒng)計學差異(p0.05)。流式分析檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124能逆轉il-6對modcsccr7表達的抑制,il-6(100ng/ml)+jsi-124+lps組modcsccr7表達率為83.0±1.2,明顯高于il-6(100ng/ml)+lps組(15.4±0.9)(p0.05)。transwell細胞遷移實驗檢測發(fā)現(xiàn)jsi-124還能逆轉il-6對modcs遷移的抑制,il-6(100ng/ml)+JSI-124+LPS組moDCs的遷移率為74.5±3.3,明顯高于IL-6(100ng/ml)+LPS組(26.2±2.1)(P0.05)。四、研究結論1、IL-6對moDCs的表型成熟分子DC86、DC83、HLA-DR的表達沒有抑制作用,而對moDCsCCR7mRNA的表達有明顯抑制作用。2、IL-6能明顯激活moDCs內STAT3信號通路和ERK信號通路。3、JSI-124抑制p-STAT3表達后,能逆轉IL-6對moDCs CCR7mRNA表達的抑制,而p-ERK抑制劑PD98059卻不能。而且JSI-124還能逆轉IL-6對moDCsCCR7表達和遷移能力的抑制。結果提示IL-6通過STAT3信號通路,而不通過ERK信號通路抑制moDCsCCR7的表達和細胞遷移能力。STAT3可能成為干預moDCs遷移障礙的分子靶點,為糾正腫瘤患者的免疫缺陷提供理論支撐。
【關鍵詞】：IL-6 人單核細胞來源樹突狀細胞 樹突狀細胞 腫瘤微環(huán)境 細胞趨化因子受體7 信號轉導和轉錄激活因子3 細胞外調節(jié)蛋白激酶
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.3
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-17
• 第二章 體外建立IL-6 抑制人外周血單核細胞來源樹突狀細胞CCR7表達模型17-34
• 2.1 材料和方法17-25
• 2.2 實驗結果25-30
• 2.3 討論30-33
• 2.4 小結33-34
• 第三章 IL-6 對單核細胞來源樹突狀細胞內STAT3信號通路和ERK信號通路的影響34-43
• 3.1 材料和方法34-38
• 3.2 實驗結果38-40
• 3.3 討論40-42
• 3.4 小結42-43
• 第四章 STAT3信號通路和ERK信號通路在IL-6 抑制人單核細胞來源樹突狀細胞CCR7表達中的作用43-60
• 4.1 材料和方法43-53
• 4.2 實驗結果53-57
• 4.3 討論57-59
• 4.4 小結59-60
• 全文結論60-61
• 參考文獻61-66
• 文獻綜述 腫瘤微環(huán)境中IL-6 與樹突狀細胞的研究進展66-74
• 參考文獻71-74
• 碩士期間發(fā)表的論文74-75
• 致謝75

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本文編號：1114150