本文關(guān)鍵詞：MIF通過(guò)ERK信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的:從細(xì)胞層面上研究MIF通過(guò)ERK信號(hào)途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,為進(jìn)一步研發(fā)以MIF為靶點(diǎn)治療HCC的藥物研發(fā)建立理論基礎(chǔ)。方法:首先,將MIF(50 ng/ml,100 ng/ml,200 ng/ml)加入肝癌細(xì)胞HepG2作為實(shí)驗(yàn)組,MIF(50 ng/ml,100 ng/ml,200 ng/ml)加入肝硬化細(xì)胞QSG-7701和正常肝細(xì)胞L-02中作為對(duì)照組,將MIF拮抗劑ISO-1(50μM)加入肝癌細(xì)胞HepG2中作為陰性對(duì)照組,各組細(xì)胞設(shè)一組空白對(duì)照組,只加入培養(yǎng)基。通過(guò)MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞存活率來(lái)篩選MIF最佳濃度。其次,培養(yǎng)各組細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞,用Real time-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞ERK基因表達(dá),用Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞ERK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平(p-ERK)。結(jié)果:1.MIF具有明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖作用,在HepG2作用最為顯著;2.MTT法可得出在同一時(shí)間,隨著濃度升高M(jìn)IF促增殖作用逐漸增強(qiáng),濃度為200ng/ml時(shí)細(xì)胞增殖最顯著,在HepG2作用更為顯著;3.Real time-PCR檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)與對(duì)照組相比,ERK基因表達(dá)量是上調(diào)的,在MIF濃度最大時(shí)(200 ng/ml)ERK基因的表達(dá)與低濃度組及對(duì)照組相比增多最為顯著(P0.05),HepG2與QSG-7701、L-02比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),QSG-7701與L-02比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western-blot結(jié)果提示不同濃度MIF組ERK蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異,而p-ERK的表達(dá)是上調(diào)的,其中MIF濃度為200 ng/ml時(shí)p-ERK蛋白表達(dá)較低濃度組及對(duì)照組明顯增多(P0.05),HepG2與QSG-7701、L-02比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),QSG-7701與L-02比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.ISO-1通過(guò)抑制MIF表達(dá),下調(diào)ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá),抑制HepG2細(xì)胞增殖,Real time-PCR檢測(cè)顯示與MIF組相比,ERK基因表達(dá)量下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western-blot結(jié)果提示ISO-1組與MIF組及對(duì)照組比較,ERK蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P0.05),而p-ERK蛋白表達(dá)下調(diào)并差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:MIF能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖,并且是通過(guò)ERK信號(hào)通路發(fā)生磷酸化促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶 肝癌細(xì)胞 增殖
【學(xué)位授予單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 中英文縮略對(duì)照詞表8-9
• 前言9-11
• 立題依據(jù)11-13
• 實(shí)驗(yàn)研究13-32
• 1. 材料13-16
• 1.1 主要儀器13-14
• 1.2 主要試劑與材料14-16
• 1.2.1 試劑與材料14-15
• 1.2.2 配制實(shí)驗(yàn)試劑15-16
• 2. 方法16-22
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)16-17
• 2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇16
• 2.1.2 細(xì)胞傳代16-17
• 2.1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)17
• 2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞存活率并篩選MIF最佳濃度17-18
• 2.3 Real time-PCR檢測(cè)ERK基因表達(dá)18-20
• 2.3.1 提取細(xì)胞中總RNA18
• 2.3.2 RNA純度檢測(cè)18-19
• 2.3.3 RNA的反轉(zhuǎn)錄19
• 2.3.4 對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)19-20
• 2.4 Western-blot測(cè)ERK、p-ERK蛋白表達(dá)20-22
• 2.4.1 提取細(xì)胞中總蛋白20
• 2.4.2 蛋白BCA定量20-21
• 2.4.3 Western-blot檢測(cè)ERK、p-ERK蛋白表達(dá)21-22
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析22
• 3. 結(jié)果22-29
• 3.1 MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞存活率，篩選MIF促增殖作用最佳濃度22
• 3.2 ERK基因的檢測(cè)22-25
• 3.3 ERK、p-ERK蛋白的檢測(cè)25-29
• 4. 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-39
• 綜述39-49
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49-50
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究工作與成果50

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1112012