本文關(guān)鍵詞：MDM2的N端結(jié)構(gòu)域和中央結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及蛋白純化

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【摘要】：MDM2為小鼠雙微體基因,是RING家族的泛素化E3連接酶,其主要的生物學(xué)作用有增強(qiáng)細(xì)胞的生存活力和延長(zhǎng)細(xì)胞生存期。研究表明,MDM2參與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的重要作用使其成為腫瘤研究的興趣點(diǎn)之一。p53是一個(gè)重要的抑癌蛋白,能夠維持基因組的完整性,通過(guò)引起細(xì)胞周期阻滯和凋亡來(lái)應(yīng)答細(xì)胞阻力。正常生理情況下,p53表現(xiàn)出低水平,當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后,p53表現(xiàn)出高水平并且穩(wěn)定性增強(qiáng),進(jìn)而參與細(xì)胞衰老、DNA修復(fù)以及細(xì)胞凋亡等一系列重要的生命過(guò)程。p53過(guò)度表達(dá)或不當(dāng)?shù)募せ罹苁辜?xì)胞死亡,而表達(dá)減少或失活則導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。然而,p53在大多數(shù)人類(lèi)癌癥中表現(xiàn)為突變或功能失活,這就為基于p53的激活提供了一個(gè)很有吸引力的腫瘤治療策略,雖然臨床已經(jīng)批準(zhǔn),但p53活化劑的研制仍然未能實(shí)現(xiàn)。MDM2抑癌的機(jī)制則為MDM2蛋白是重要的p35功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一,通過(guò)與抑癌基因p53結(jié)合,介導(dǎo)p53泛素化蛋白水解酶途徑的降解。而對(duì)于MDM2的N端部分結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域以及中央結(jié)構(gòu)域(鋅指結(jié)構(gòu)域酸性結(jié)構(gòu)域)是否是p53的主要結(jié)合部位,至今沒(méi)有相關(guān)報(bào)道,因此,著重對(duì)MDM2這些結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)研究對(duì)腫瘤預(yù)防具有重要的生物學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建含His-sumo標(biāo)簽的重組質(zhì)粒以得到融合蛋白。方法是利用PCR技術(shù)從MDM2基因文庫(kù)中擴(kuò)增出MDM2的N端部分結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域以及中央結(jié)構(gòu)域基因的編碼序列,插入pp SUMO載體中得到重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑選小量誘導(dǎo)出的重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化其表達(dá)條件,利用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白純度及分子量分析,在前者的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)了轉(zhuǎn)膜及雜交等步驟,即用Western blot分析目的蛋白的表達(dá)量,待膠圖得到單一目的條帶時(shí)進(jìn)行分子篩或離子交換分析其是否以單體狀態(tài)存在。結(jié)果是重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中成功表達(dá),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后純化目的蛋白,得到相對(duì)分子質(zhì)量約為26k Da的N端部分結(jié)構(gòu)域蛋白、約為21k Da的鋅指融合蛋白和相對(duì)分子質(zhì)量約為31k Da的中央結(jié)構(gòu)域融合蛋白,為了切除SUMO標(biāo)簽故進(jìn)行了ULP1蛋白酶的純化。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功得到MDM2的N端部分結(jié)構(gòu)域蛋白、鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白和中央結(jié)構(gòu)域蛋白,為后續(xù)的蛋白結(jié)晶和三維結(jié)構(gòu)的研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：MDM2的N端結(jié)構(gòu)域 MDM2的鋅指結(jié)構(gòu)域 MDM2的中央結(jié)構(gòu)域 原核表達(dá) 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R730.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第1章 緒論11-16
• 1.1 前言11-15
• 1.1.1 MDM2蛋白的結(jié)構(gòu)12
• 1.1.2 MDM2的生物學(xué)功能12-13
• 1.1.3 MDM2與p53的關(guān)系13
• 1.1.4 MDM2與p53相互作用機(jī)制13-14
• 1.1.5 MDM2與p53的相互作用模式14
• 1.1.6 MDM2拮抗劑的研發(fā)14-15
• 1.2 技術(shù)路線15-16
• 第2章 MDM2的鋅指結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建及蛋白純化16-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料16-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備16-18
• 2.1.2 試劑及材料18
• 2.2 常用試劑配置18-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法20-27
• 2.3.1 基因克隆20-24
• 2.3.2 誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化24-27
• 2.4 結(jié)果和討論27-45
• 2.4.1 鋅指結(jié)構(gòu)域基因克隆27-29
• 2.4.2 鋅指蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)29-30
• 2.4.3 鋅指融合蛋白的純化30-45
• 2.5 討論45-46
• 2.6 本章小結(jié)46-47
• 第3章 MDM2的中央結(jié)構(gòu)域的原核基因表達(dá)及蛋白純化47-62
• 3.1 概述47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑47
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑配制47
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法47-49
• 3.3.1 基因克隆47-49
• 3.4 結(jié)果與討論49-60
• 3.4.1 基因克隆與質(zhì)粒構(gòu)建49-54
• 3.4.2 蛋白純化54-60
• 3.5 討論60-61
• 3.6 本章小結(jié)61-62
• 第4章 MDM2的N端結(jié)構(gòu)域的研究62-69
• 4.1 實(shí)驗(yàn)方法62-65
• 4.1.1 基因克隆62-65
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-67
• 4.3 討論67-68
• 4.4 本章小結(jié)68-69
• 第5章 ULP1蛋白酶的制備69-77
• 5.1 ULP1概述69-70
• 5.2 課題設(shè)計(jì)與結(jié)果70-75
• 5.3 討論75
• 5.4 本章小結(jié)75-77
• 第6章 總結(jié)與展望77-79
• 6.1 總結(jié)77
• 6.1.1 MDM2的鋅指結(jié)構(gòu)域、中央結(jié)構(gòu)域及N端結(jié)構(gòu)域的研究77
• 6.1.2 ULP1蛋白酶的純化77
• 6.2 展望77-79
• REFERENCES79-85
• 致謝85-86
• 附錄86-88

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