本文關(guān)鍵詞：MDM2的N端結(jié)構(gòu)域和中央結(jié)構(gòu)域的原核表達及蛋白純化

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【摘要】：MDM2為小鼠雙微體基因,是RING家族的泛素化E3連接酶,其主要的生物學(xué)作用有增強細胞的生存活力和延長細胞生存期。研究表明,MDM2參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及在細胞周期調(diào)節(jié)中的重要作用使其成為腫瘤研究的興趣點之一。p53是一個重要的抑癌蛋白,能夠維持基因組的完整性,通過引起細胞周期阻滯和凋亡來應(yīng)答細胞阻力。正常生理情況下,p53表現(xiàn)出低水平,當(dāng)細胞受到外界刺激后,p53表現(xiàn)出高水平并且穩(wěn)定性增強,進而參與細胞衰老、DNA修復(fù)以及細胞凋亡等一系列重要的生命過程。p53過度表達或不當(dāng)?shù)募せ罹苁辜毎劳?而表達減少或失活則導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。然而,p53在大多數(shù)人類癌癥中表現(xiàn)為突變或功能失活,這就為基于p53的激活提供了一個很有吸引力的腫瘤治療策略,雖然臨床已經(jīng)批準,但p53活化劑的研制仍然未能實現(xiàn)。MDM2抑癌的機制則為MDM2蛋白是重要的p35功能負性調(diào)節(jié)因子之一,通過與抑癌基因p53結(jié)合,介導(dǎo)p53泛素化蛋白水解酶途徑的降解。而對于MDM2的N端部分結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域以及中央結(jié)構(gòu)域(鋅指結(jié)構(gòu)域酸性結(jié)構(gòu)域)是否是p53的主要結(jié)合部位,至今沒有相關(guān)報道,因此,著重對MDM2這些結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)研究對腫瘤預(yù)防具有重要的生物學(xué)意義。本實驗的目的是構(gòu)建含His-sumo標簽的重組質(zhì)粒以得到融合蛋白。方法是利用PCR技術(shù)從MDM2基因文庫中擴增出MDM2的N端部分結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域以及中央結(jié)構(gòu)域基因的編碼序列,插入pp SUMO載體中得到重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑選小量誘導(dǎo)出的重組質(zhì)粒的菌落進行誘導(dǎo)表達并優(yōu)化其表達條件,利用SDS-PAGE進行蛋白純度及分子量分析,在前者的基礎(chǔ)上經(jīng)過了轉(zhuǎn)膜及雜交等步驟,即用Western blot分析目的蛋白的表達量,待膠圖得到單一目的條帶時進行分子篩或離子交換分析其是否以單體狀態(tài)存在。結(jié)果是重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中成功表達,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后純化目的蛋白,得到相對分子質(zhì)量約為26k Da的N端部分結(jié)構(gòu)域蛋白、約為21k Da的鋅指融合蛋白和相對分子質(zhì)量約為31k Da的中央結(jié)構(gòu)域融合蛋白,為了切除SUMO標簽故進行了ULP1蛋白酶的純化。結(jié)論:本實驗成功得到MDM2的N端部分結(jié)構(gòu)域蛋白、鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白和中央結(jié)構(gòu)域蛋白,為后續(xù)的蛋白結(jié)晶和三維結(jié)構(gòu)的研究奠定堅實基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：MDM2的N端結(jié)構(gòu)域 MDM2的鋅指結(jié)構(gòu)域 MDM2的中央結(jié)構(gòu)域 原核表達 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R730.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第1章 緒論11-16
• 1.1 前言11-15
• 1.1.1 MDM2蛋白的結(jié)構(gòu)12
• 1.1.2 MDM2的生物學(xué)功能12-13
• 1.1.3 MDM2與p53的關(guān)系13
• 1.1.4 MDM2與p53相互作用機制13-14
• 1.1.5 MDM2與p53的相互作用模式14
• 1.1.6 MDM2拮抗劑的研發(fā)14-15
• 1.2 技術(shù)路線15-16
• 第2章 MDM2的鋅指結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建及蛋白純化16-47
• 2.1 實驗儀器與材料16-18
• 2.1.1 實驗儀器及設(shè)備16-18
• 2.1.2 試劑及材料18
• 2.2 常用試劑配置18-20
• 2.3 實驗方法20-27
• 2.3.1 基因克隆20-24
• 2.3.2 誘導(dǎo)表達及蛋白純化24-27
• 2.4 結(jié)果和討論27-45
• 2.4.1 鋅指結(jié)構(gòu)域基因克隆27-29
• 2.4.2 鋅指蛋白的誘導(dǎo)表達29-30
• 2.4.3 鋅指融合蛋白的純化30-45
• 2.5 討論45-46
• 2.6 本章小結(jié)46-47
• 第3章 MDM2的中央結(jié)構(gòu)域的原核基因表達及蛋白純化47-62
• 3.1 概述47
• 3.2 實驗儀器與試劑47
• 3.2.1 實驗儀器及試劑配制47
• 3.3 實驗方法47-49
• 3.3.1 基因克隆47-49
• 3.4 結(jié)果與討論49-60
• 3.4.1 基因克隆與質(zhì)粒構(gòu)建49-54
• 3.4.2 蛋白純化54-60
• 3.5 討論60-61
• 3.6 本章小結(jié)61-62
• 第4章 MDM2的N端結(jié)構(gòu)域的研究62-69
• 4.1 實驗方法62-65
• 4.1.1 基因克隆62-65
• 4.2 實驗結(jié)果65-67
• 4.3 討論67-68
• 4.4 本章小結(jié)68-69
• 第5章 ULP1蛋白酶的制備69-77
• 5.1 ULP1概述69-70
• 5.2 課題設(shè)計與結(jié)果70-75
• 5.3 討論75
• 5.4 本章小結(jié)75-77
• 第6章 總結(jié)與展望77-79
• 6.1 總結(jié)77
• 6.1.1 MDM2的鋅指結(jié)構(gòu)域、中央結(jié)構(gòu)域及N端結(jié)構(gòu)域的研究77
• 6.1.2 ULP1蛋白酶的純化77
• 6.2 展望77-79
• REFERENCES79-85
• 致謝85-86
• 附錄86-88

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