本文關(guān)鍵詞：BTBD10對人腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺化療敏感性的影響及機制探討

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【摘要】：腦膠質(zhì)瘤大約占原發(fā)性腦腫瘤的40-50%,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤類型。盡管在過去的幾十年中,醫(yī)療設備和手術(shù)技術(shù)得到了飛速發(fā)展,但是惡性膠質(zhì)瘤所造成的死亡率和致殘率仍然居高不下,其中5年生存率不足10%。特別是病理組織學中惡性程度最高的膠質(zhì)母細胞瘤(GBM),預后最差。造成這種情況的原因有很多,包括腫瘤的彌漫浸潤性生長方式、血腦屏障的影響、化療藥物劑量不足等等。與手術(shù)切除和放射治療相比,化療在提高膠質(zhì)瘤患者生存時間上的貢獻較為有限。其中化療耐藥性的存在是制約其療效進一步提高的重要因素。目前膠質(zhì)瘤干細胞,凋亡、自噬,多藥耐藥,DNA損傷修復是研究較為集中的化療耐藥機制。它們所涉及到的相關(guān)基因及信號轉(zhuǎn)導通路機制尚不完全明了。而作為新一代烷化劑的替莫唑胺,雖然是目前臨床上膠質(zhì)瘤的標準化療藥物,但是對其敏感性及耐藥性的差異導致患者預后的明顯不同。所以,進一步深入研究關(guān)于膠質(zhì)瘤化療耐藥性的相關(guān)分子調(diào)控機制,能夠為提高患者的化療療效開辟新的道路。在先前的研究中,我們利用基因表達譜芯片對腦膠質(zhì)瘤標本進行篩查分析,數(shù)據(jù)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)含有BTB/POZ結(jié)構(gòu)域的BTBD10表達量有顯著下調(diào)。查閱文獻獲知,BTB/POZ蛋白家族成員參與多種細胞生理過程,其可能的作用機制包括介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的自聯(lián),通過形成二聚體或多聚體選擇性地與DNA相互作用,調(diào)節(jié)基因開關(guān),參與基因的表達調(diào)控,以及細胞的增殖、分化、凋亡等功能。為此,前期我們以BTBD10作為研究對象,運用RT-PCR、Northern、Western-blot以及構(gòu)建BTBD10慢病毒表達載體等技術(shù)手段,對各級別腦膠質(zhì)瘤組織標本及U251細胞株進行了BTBD10表達量的鑒定以及檢測它對細胞增殖和凋亡的影響。實驗結(jié)果顯示,相較于正常人腦組織,BTBD10的表達在各級別膠質(zhì)瘤中均下調(diào),并且其表達水平與腫瘤的惡性級別呈負相關(guān),即級別越高表達量越低。同時,在過表達BTBD10的U251細胞中證實,BTBD10可以通過抑制PI3K/Akt信號通路的活性,抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖,促進凋亡。因此,可以初步認為BTBD10作為抑癌基因可以成為膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點。當然,要真正了解BTBD10的相關(guān)功能及作用機制還需要我們繼續(xù)深入的研究。本實驗擬于四個GBMs細胞株中篩選出BTBD10低表達者,通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達BTBD10的GBMs細胞株,測定其對TMZ化療的敏感性變化以及經(jīng)TMZ處理后GBMs細胞株在增殖、侵襲、凋亡方面的改變。最后,通過檢測凋亡、自噬、多藥耐藥、DNA修復這四種機制中的相關(guān)蛋白的表達水平,探討過表達BTBD10引起的GBMs細胞株化療敏感性變化的可能作用機制。實驗分為二個部分:第一部分,慢病毒過表達BTBD10后對GBMs細胞株化療敏感性的影響;第二部分,過表達BTBD10后U251、U87細胞株化療敏感性變化的機制探討。第一部分慢病毒過表達BTBD10后對GBMs細胞株化療敏感性的影響目的:本部分實驗旨在通過篩選GBMs細胞株,構(gòu)建過表達BTBD10載體,驗證過表達BTBD10后GBMs細胞株對TMZ化療敏感性的變化。方法:應用Real-time PCR方法檢測U87、U251、A172、U373這四個GBMs細胞株中BTBD10的m RNA表達水平。構(gòu)建BTBD10過表達慢病毒載體,選擇轉(zhuǎn)染低表達BTBD10的兩個細胞株,采用Real-time PCR和Western-blot方法檢驗轉(zhuǎn)染效率。將U251及U87細胞均分為空白對照(CON)、空載(NC)及過表達(OE)BTBD10三組。依據(jù)CCK-8法測定的IC50值鑒別過表達BTBD10引起的膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的化療敏感性變化。結(jié)果:四個GBMs細胞株中U251、U87的BTBD10m RNA表達量較低,與A172、U373之間均達到統(tǒng)計學差異(P㩳0.05)。成功構(gòu)建BTBD10過表達慢病毒載體,轉(zhuǎn)染U251、U87后BTBD10的m RNA表達水平分別為轉(zhuǎn)染前的11.43倍和43.92倍。同時BTBD10蛋白表達水平也明顯增高,與m RNA水平趨勢一致。U251細胞中OE組、CON組和NC組細胞對TMZ的IC50值分別10.31mg/L、19.78mg/L、19.84mg/L。U87細胞中OE組、CON組和NC組細胞的IC50值分別為8.628 mg/L,16.36mg/L、16.71 mg/L。這兩株細胞中,OE組的IC50值均明顯低于CON組和NC組(P㩳0.05)。結(jié)論:BTBD10的表達水平與GBMs細胞對TMZ的化療敏感性呈正相關(guān),過表達BTBD10能夠增加U251、U87細胞對TMZ的化療敏感性。第二部分過表達BTBD10后U251、U87細胞株化療敏感性變化的機制探討目的:本部分實驗研究過表達BTBD10后U251、U87細胞株的在增殖、侵襲、凋亡方面的變化并探討腫瘤細胞對TMZ化療敏感性增加的可能機制。方法:應用MTT法、Transwell法及流式細胞儀分別檢測U251、U87三組細胞經(jīng)TMZ誘導后的增殖情況、侵襲力及凋亡水平。同時,應用Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、Caspase3,自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclinl,多藥耐藥蛋白ABCC1、ABCB1,損傷修復蛋白MGMT、ERCC2的表達水平。結(jié)果:MTT結(jié)果提示U251、U87細胞中根據(jù)OD490的變化倍數(shù),OE組細胞的增殖倍數(shù)較CON組及NC組明顯降低,達到統(tǒng)計學差異(P㩳0.05)。Transwell結(jié)果提示,在U251、U87細胞中OE組相比CON組及NC組轉(zhuǎn)移細胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異(P㧐0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果提示,U251、U87細胞中OE組相比CON組、NC組細胞凋亡率有明顯上升,達到統(tǒng)計學顯著差異(P㩳0.05)。耐藥相關(guān)蛋白檢測結(jié)果提示,U251、U87細胞過表達BTBD10時,Bcl-2、ABCC1、ABCB1表達減少,Caspase3表達升高,且OE組相比CON組、NC組的表達差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05),而LC3、Beclin1、MGMT、ERCC2的表達無明顯差異(P㧐0.05)。結(jié)論:過表達BDBT10的U251、U87細胞增殖能力受到抑制,凋亡水平增高,而細胞的侵襲能力并沒有顯著改變,并且其對TMZ的化療敏感性變化可能是通過凋亡及多藥耐藥相關(guān)途徑實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)母細胞瘤 替莫唑胺 半抑制濃度 化療敏感性 增殖 侵襲 凋亡 化療耐藥
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫詞表12-14
• 第一部分 慢病毒過表達BTBD10后對GBMs細胞株化療敏感性的影響14-44
• 一、前言14-15
• 二、材料和方法15-29
• 三、結(jié)果29-41
• 四、討論41-44
• 第二部分 過表達BTBD10后U251、U87細胞株化療敏感性變化的機制探討44-60
• 一、前言44-45
• 二、材料與方法45-48
• 三、結(jié)果48-55
• 四、討論55-60
• 全文總結(jié)60-61
• 參考文獻61-68
• 綜述：BTBD10 的研究現(xiàn)狀與進展68-74
• 參考文獻72-74
• 碩士期間發(fā)表文章和參加會議74-75
• 致謝75

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本文編號：1108296