發(fā)布時間：2017-10-28 12:33

  本文關(guān)鍵詞：BTBD10對人腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺化療敏感性的影響及機(jī)制探討

  更多相關(guān)文章： 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 替莫唑胺 半抑制濃度 化療敏感性 增殖 侵襲 凋亡 化療耐藥

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤大約占原發(fā)性腦腫瘤的40-50%,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤類型。盡管在過去的幾十年中,醫(yī)療設(shè)備和手術(shù)技術(shù)得到了飛速發(fā)展,但是惡性膠質(zhì)瘤所造成的死亡率和致殘率仍然居高不下,其中5年生存率不足10%。特別是病理組織學(xué)中惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM),預(yù)后最差。造成這種情況的原因有很多,包括腫瘤的彌漫浸潤性生長方式、血腦屏障的影響、化療藥物劑量不足等等。與手術(shù)切除和放射治療相比,化療在提高膠質(zhì)瘤患者生存時間上的貢獻(xiàn)較為有限。其中化療耐藥性的存在是制約其療效進(jìn)一步提高的重要因素。目前膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,凋亡、自噬,多藥耐藥,DNA損傷修復(fù)是研究較為集中的化療耐藥機(jī)制。它們所涉及到的相關(guān)基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制尚不完全明了。而作為新一代烷化劑的替莫唑胺,雖然是目前臨床上膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物,但是對其敏感性及耐藥性的差異導(dǎo)致患者預(yù)后的明顯不同。所以,進(jìn)一步深入研究關(guān)于膠質(zhì)瘤化療耐藥性的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制,能夠為提高患者的化療療效開辟新的道路。在先前的研究中,我們利用基因表達(dá)譜芯片對腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行篩查分析,數(shù)據(jù)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)含有BTB/POZ結(jié)構(gòu)域的BTBD10表達(dá)量有顯著下調(diào)。查閱文獻(xiàn)獲知,BTB/POZ蛋白家族成員參與多種細(xì)胞生理過程,其可能的作用機(jī)制包括介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的自聯(lián),通過形成二聚體或多聚體選擇性地與DNA相互作用,調(diào)節(jié)基因開關(guān),參與基因的表達(dá)調(diào)控,以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等功能。為此,前期我們以BTBD10作為研究對象,運(yùn)用RT-PCR、Northern、Western-blot以及構(gòu)建BTBD10慢病毒表達(dá)載體等技術(shù)手段,對各級別腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及U251細(xì)胞株進(jìn)行了BTBD10表達(dá)量的鑒定以及檢測它對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。實(shí)驗結(jié)果顯示,相較于正常人腦組織,BTBD10的表達(dá)在各級別膠質(zhì)瘤中均下調(diào),并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性級別呈負(fù)相關(guān),即級別越高表達(dá)量越低。同時,在過表達(dá)BTBD10的U251細(xì)胞中證實(shí),BTBD10可以通過抑制PI3K/Akt信號通路的活性,抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡。因此,可以初步認(rèn)為BTBD10作為抑癌基因可以成為膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)。當(dāng)然,要真正了解BTBD10的相關(guān)功能及作用機(jī)制還需要我們繼續(xù)深入的研究。本實(shí)驗擬于四個GBMs細(xì)胞株中篩選出BTBD10低表達(dá)者,通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達(dá)BTBD10的GBMs細(xì)胞株,測定其對TMZ化療的敏感性變化以及經(jīng)TMZ處理后GBMs細(xì)胞株在增殖、侵襲、凋亡方面的改變。最后,通過檢測凋亡、自噬、多藥耐藥、DNA修復(fù)這四種機(jī)制中的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,探討過表達(dá)BTBD10引起的GBMs細(xì)胞株化療敏感性變化的可能作用機(jī)制。實(shí)驗分為二個部分:第一部分,慢病毒過表達(dá)BTBD10后對GBMs細(xì)胞株化療敏感性的影響;第二部分,過表達(dá)BTBD10后U251、U87細(xì)胞株化療敏感性變化的機(jī)制探討。第一部分慢病毒過表達(dá)BTBD10后對GBMs細(xì)胞株化療敏感性的影響目的:本部分實(shí)驗旨在通過篩選GBMs細(xì)胞株,構(gòu)建過表達(dá)BTBD10載體,驗證過表達(dá)BTBD10后GBMs細(xì)胞株對TMZ化療敏感性的變化。方法:應(yīng)用Real-time PCR方法檢測U87、U251、A172、U373這四個GBMs細(xì)胞株中BTBD10的m RNA表達(dá)水平。構(gòu)建BTBD10過表達(dá)慢病毒載體,選擇轉(zhuǎn)染低表達(dá)BTBD10的兩個細(xì)胞株,采用Real-time PCR和Western-blot方法檢驗轉(zhuǎn)染效率。將U251及U87細(xì)胞均分為空白對照(CON)、空載(NC)及過表達(dá)(OE)BTBD10三組。依據(jù)CCK-8法測定的IC50值鑒別過表達(dá)BTBD10引起的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ的化療敏感性變化。結(jié)果:四個GBMs細(xì)胞株中U251、U87的BTBD10m RNA表達(dá)量較低,與A172、U373之間均達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異(P㩳0.05)。成功構(gòu)建BTBD10過表達(dá)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染U251、U87后BTBD10的m RNA表達(dá)水平分別為轉(zhuǎn)染前的11.43倍和43.92倍。同時BTBD10蛋白表達(dá)水平也明顯增高,與m RNA水平趨勢一致。U251細(xì)胞中OE組、CON組和NC組細(xì)胞對TMZ的IC50值分別10.31mg/L、19.78mg/L、19.84mg/L。U87細(xì)胞中OE組、CON組和NC組細(xì)胞的IC50值分別為8.628 mg/L,16.36mg/L、16.71 mg/L。這兩株細(xì)胞中,OE組的IC50值均明顯低于CON組和NC組(P㩳0.05)。結(jié)論:BTBD10的表達(dá)水平與GBMs細(xì)胞對TMZ的化療敏感性呈正相關(guān),過表達(dá)BTBD10能夠增加U251、U87細(xì)胞對TMZ的化療敏感性。第二部分過表達(dá)BTBD10后U251、U87細(xì)胞株化療敏感性變化的機(jī)制探討目的:本部分實(shí)驗研究過表達(dá)BTBD10后U251、U87細(xì)胞株的在增殖、侵襲、凋亡方面的變化并探討腫瘤細(xì)胞對TMZ化療敏感性增加的可能機(jī)制。方法:應(yīng)用MTT法、Transwell法及流式細(xì)胞儀分別檢測U251、U87三組細(xì)胞經(jīng)TMZ誘導(dǎo)后的增殖情況、侵襲力及凋亡水平。同時,應(yīng)用Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、Caspase3,自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclinl,多藥耐藥蛋白ABCC1、ABCB1,損傷修復(fù)蛋白MGMT、ERCC2的表達(dá)水平。結(jié)果:MTT結(jié)果提示U251、U87細(xì)胞中根據(jù)OD490的變化倍數(shù),OE組細(xì)胞的增殖倍數(shù)較CON組及NC組明顯降低,達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異(P㩳0.05)。Transwell結(jié)果提示,在U251、U87細(xì)胞中OE組相比CON組及NC組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P㧐0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示,U251、U87細(xì)胞中OE組相比CON組、NC組細(xì)胞凋亡率有明顯上升,達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P㩳0.05)。耐藥相關(guān)蛋白檢測結(jié)果提示,U251、U87細(xì)胞過表達(dá)BTBD10時,Bcl-2、ABCC1、ABCB1表達(dá)減少,Caspase3表達(dá)升高,且OE組相比CON組、NC組的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05),而LC3、Beclin1、MGMT、ERCC2的表達(dá)無明顯差異(P㧐0.05)。結(jié)論:過表達(dá)BDBT10的U251、U87細(xì)胞增殖能力受到抑制,凋亡水平增高,而細(xì)胞的侵襲能力并沒有顯著改變,并且其對TMZ的化療敏感性變化可能是通過凋亡及多藥耐藥相關(guān)途徑實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 替莫唑胺 半抑制濃度 化療敏感性 增殖 侵襲 凋亡 化療耐藥
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫詞表12-14
• 第一部分 慢病毒過表達(dá)BTBD10后對GBMs細(xì)胞株化療敏感性的影響14-44
• 一、前言14-15
• 二、材料和方法15-29
• 三、結(jié)果29-41
• 四、討論41-44
• 第二部分 過表達(dá)BTBD10后U251、U87細(xì)胞株化療敏感性變化的機(jī)制探討44-60
• 一、前言44-45
• 二、材料與方法45-48
• 三、結(jié)果48-55
• 四、討論55-60
• 全文總結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 綜述：BTBD10 的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展68-74
• 參考文獻(xiàn)72-74
• 碩士期間發(fā)表文章和參加會議74-75
• 致謝75

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本文編號：1108296