本文關(guān)鍵詞：探討SNHG3在肝癌中的表達(dá)及臨床意義

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【摘要】：研究背景及目的在人類疾病中常出現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(1ncRNAs)調(diào)控紊亂,這一現(xiàn)象在癌癥中尤為明顯。癌癥基因組的雜亂無(wú)章及不穩(wěn)定,主要表現(xiàn)為體細(xì)胞拷貝數(shù)變化(SCNAs),而這些體細(xì)胞拷貝數(shù)變化可能引發(fā)癌癥。大規(guī)模的基因組資料和全基因組功能篩查已經(jīng)成功地應(yīng)用于識(shí)別引發(fā)癌癥的體細(xì)胞拷貝數(shù)變化位點(diǎn)。然而,蛋白編碼基因僅占人類基因組的2%,許多癌癥病灶的體細(xì)胞拷貝數(shù)變化位點(diǎn)不具有蛋白編碼功能。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)也表明,人類大部分基因組具有轉(zhuǎn)錄活性,但僅有小部分是蛋白編碼基因,這些發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識(shí)到人類基因組包含了眾多長(zhǎng)鏈非編碼RNA。此外,長(zhǎng)鏈非編碼RNA在一系列不同類型的細(xì)胞和疾病中發(fā)揮著重要的作用,參與調(diào)控細(xì)胞的不同生物學(xué)進(jìn)程,包括細(xì)胞周期、基因穩(wěn)定性及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等,這表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控幾乎無(wú)處不在。然而,大部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA的作用機(jī)制仍不清楚。因此,進(jìn)一步探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA確切的作用機(jī)制及功能有助于我們了解其對(duì)人類癌癥的影響。小核仁RNA宿主基因3(SNHG3)是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA,目前,它在肝癌中的潛在作用及機(jī)制尚未有報(bào)道。SNHG3,也稱為U17的宿主基因(U17HG),位于1號(hào)染色體短臂3區(qū)6號(hào)帶�；騼�(nèi)的U17小核仁RNA宿主基因最初由PelczarP發(fā)現(xiàn)。這位學(xué)者將人類和老鼠的U17HG進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)物種間小核仁RNA沒有蛋白編碼特性。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),在7對(duì)肝癌組織標(biāo)本的芯片結(jié)果中,SNHG3在肝癌組織中的表達(dá)高于正常肝臟組織。然而,目前有關(guān)SNHG3作用的研究極少,其在肝癌中高表達(dá)是否暗含著重大的功能意義尚不清楚。本文的研究目的正是檢測(cè)肝癌中SNHG3的表達(dá)及其臨床意義。主要思路為：通過qRT-PCR方法檢測(cè)51對(duì)肝癌組織標(biāo)本(隊(duì)列1)中SNHG3的表達(dá),同時(shí)也用原位雜交的方法檢測(cè)144對(duì)石蠟包埋的肝癌組織標(biāo)本(隊(duì)列2)中SNHG3的表達(dá)。然后,分析隊(duì)列2中SNHG3的表達(dá)和患者臨床病理特征間的關(guān)系。最后,使用COX回歸模型進(jìn)行多因素分析,并結(jié)合SNHG3的表達(dá)與肝癌患者的總生存時(shí)間、無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間及無(wú)病生存時(shí)間的關(guān)系,明確SNHG3對(duì)肝癌患者的預(yù)后價(jià)值。研究?jī)?nèi)容一.方法1.組織樣本和患者數(shù)據(jù)所有樣本的獲取符合南方醫(yī)科大學(xué),南方醫(yī)院倫理委員會(huì)的協(xié)議,參與到本研究的肝癌患者均已簽署知情同意書。本研究納入了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的共計(jì)195位肝癌患者,在隊(duì)列1中,51對(duì)新鮮肝癌組織標(biāo)本來(lái)自2011年1月至2012年7月期間在我院進(jìn)行首次肝癌手術(shù)切除的患者,標(biāo)本在RNA提取前儲(chǔ)存在-80℃的液氮中。在隊(duì)列2中,144對(duì)石蠟包埋的肝癌組織標(biāo)本來(lái)自2006年1月份至2009年7月份期間在我院進(jìn)行首次肝癌手術(shù)切除的患者。所有這些標(biāo)本收集前均未進(jìn)行任何抗腫瘤治療,包括放療、化療和手術(shù),研究中對(duì)納入的肝癌組織樣本隨機(jī)選擇,對(duì)隊(duì)列2的患者進(jìn)行5年的隨訪,所有患者的臨床資料將在下文中進(jìn)行說(shuō)明(表2-1和表2-2)。本研究按照Edmonson和Steiner建議的標(biāo)準(zhǔn)明確腫瘤分化,按照巴塞羅那臨床肝癌分期標(biāo)準(zhǔn)定義腫瘤分期。2.提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用TRIzol(？)試劑(Invitrogen,卡爾斯巴德,美國(guó))提取組織樣本中的總RNA并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara生物技術(shù),大連,中國(guó))逆轉(zhuǎn)錄成cDNAc qRT-PCR按照Takara生物技術(shù)生產(chǎn)的SYBR(？) Green PCR試劑盒(Takara,大連,中國(guó))的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。SNHG3擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性30秒,隨后,95℃,5秒,60℃,34秒,共40個(gè)循環(huán)。所有qRT-PCR的引物特異性和效率性均經(jīng)過檢驗(yàn)。使用2-ΔΔCt相對(duì)定量方法計(jì)算倍數(shù)變化。3.原位雜交按照原位雜交試劑盒(Boster Bio-Engineering公司,武漢,中國(guó))的使用說(shuō)明進(jìn)行SNHG3原位雜交檢測(cè)。片子分別由兩位病理專家在顯微鏡下根據(jù)SNHG3陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度及比例進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度按照以下的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定義：0(陰性),1(弱陽(yáng)性),2(中等陽(yáng)性),3(強(qiáng)陽(yáng)性)。染色比例評(píng)分：0(0%),1(1%-25%),2(26%-50%),3(51%-75%),4(76%-100%)。SNHG3表達(dá)的最終評(píng)分按照染色強(qiáng)度分值+染色比例分值進(jìn)行計(jì)算,總分為0-7分�？偡种�3分或者更高為高表達(dá)組(陽(yáng)性組)。4. TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)為了明確SNHG3在肝癌中的表達(dá),本研究使用的RNA測(cè)序方法分析來(lái)自The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://tcga-data.nci.Nih. gov/tcga/)的肝癌隊(duì)列�？偣灿�401例樣本具有SNHG3表達(dá)值,其中50例是正常的肝臟組織,351例是肝癌組織。收集每例樣本中SNHG3的表達(dá)值,并在肝癌組織標(biāo)本和正常肝臟組織標(biāo)本中對(duì)比SNHG3的表達(dá)水平。5. Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)在Oncomine Compendium of Expression Array data (www.oncomine.org)下載了一組Wurmbach Liver的芯片結(jié)果。使用Affymetrix U133 Plus 2.0基因芯片分析45例肝臟組織樣本,包括35例肝癌組織樣本和10例正常組織樣本,在肝癌組織樣本和正常組織樣本中對(duì)比SNHG3的表達(dá)水平。該芯片數(shù)據(jù)結(jié)果可在UCSC上查詢,檢索號(hào)為AJ006835。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用SPSS軟件(Abbott Laboratories, Chicago, IL)來(lái)進(jìn)行,利用生存分析和Log-rank test來(lái)檢測(cè)生存曲線,通過單因素和多因素Cox回歸模型來(lái)評(píng)估影響生存的因素,利用單因素分析明確具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素,再進(jìn)一步通過多因素分析來(lái)評(píng)估它們對(duì)肝癌預(yù)后的獨(dú)立影響價(jià)值。SNHG3的表達(dá)和臨床病理特征間的關(guān)系通過The Mann-Whitney U-test進(jìn)行檢驗(yàn),實(shí)時(shí)熒光定量和數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)通過Student's t-test進(jìn)行分析。當(dāng)P0.05時(shí),認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。二.結(jié)果1.SNHG3轉(zhuǎn)錄本在肝癌細(xì)胞株和肝癌組織中的表達(dá)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株中SNHG3轉(zhuǎn)錄本的表達(dá),長(zhǎng)度為2238bp的轉(zhuǎn)錄本在所有6株肝癌細(xì)胞株中表達(dá)量最高,而長(zhǎng)度為2346bp的轉(zhuǎn)錄本則幾乎檢測(cè)不到或低表達(dá)。在4對(duì)肝癌組織標(biāo)本中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá),也得到一致的結(jié)論。2.SNHG3在肝癌組織中高表達(dá)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)來(lái)自51位肝癌患者的肝癌組織標(biāo)本中SNHG3的表達(dá),相比正常的肝臟組織標(biāo)本,SNHG3在肝癌組織標(biāo)本中的表達(dá)升高5倍。此外,來(lái)自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(接收號(hào)AJ006835,Wurmbach,2007)的Wurmbach Liver芯片結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)集表明SNHG3在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織。為了進(jìn)一步明確以上結(jié)果,通過原位雜交的方法檢測(cè)144對(duì)石蠟包埋的肝癌組織標(biāo)本中(隊(duì)列2)SNHG3的表達(dá),與正常組織相比,SNHG3在91(63.2%)例肝癌組織中的表達(dá)明顯升高。3. SNHG3與肝癌患者臨床病理特征間的關(guān)系通過對(duì)144位肝癌患者中SNHG3的表達(dá)和臨床病理特征間的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：SNHG3的表達(dá)與腫瘤大小、門靜脈癌栓和復(fù)發(fā)相關(guān)。然而,SNHG3表達(dá)與患者性別、年齡、肝硬化、BCLC分期無(wú)關(guān)。4. SNHG3過表達(dá)是肝癌患者預(yù)后獨(dú)立的不良因素通過生存分析和Log-rank分析發(fā)現(xiàn)：SNHG3的表達(dá)與肝癌患者的總生存率、無(wú)復(fù)發(fā)生存率和無(wú)病生存率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外,單因素分析預(yù)后因素表明SNHG3表達(dá)、門靜脈癌栓、復(fù)發(fā)、BCLC分期和腫瘤大小與總生存時(shí)間明顯相關(guān)。使用Cox回歸分析模型進(jìn)行多因素分析表明SNHG3是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。三.結(jié)論1.與正常肝臟組織相比,SNHG3在肝癌組織中明顯高表達(dá)。2.SNHG3表達(dá)與腫瘤大小、門靜脈癌栓和復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。3.SNHG3高表達(dá)的肝癌患者相比SNHG3氏表達(dá)者預(yù)后差。4.SNHG3可以作為肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。
【關(guān)鍵詞】：長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG3 肝細(xì)胞癌 預(yù)后 腫瘤發(fā)生
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-23
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 第一章 SNHG3的剪切體在肝癌細(xì)胞株和肝癌中的表達(dá)23-40
• 1.1 材料和方法23-29
• 1.2 結(jié)果29-34
• 1.3 討論34-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 第二章 SNHG3在肝癌組織中的表達(dá)40-54
• 2.1 材料和方法40-46
• 2.2 結(jié)果46-48
• 2.3 討論48-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 第三章 SNHG3與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響54-61
• 3.1 材料和方法54-55
• 3.2 結(jié)果55-58
• 3.3 討論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 全文總結(jié)61-62
• 4.1 主要發(fā)現(xiàn)61
• 4.2 不足和展望61-62
• 綜述62-75
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果75-76
• 致謝76-78

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本文編號(hào)：1082148