本文關鍵詞：探討SNHG3在肝癌中的表達及臨床意義

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【摘要】：研究背景及目的在人類疾病中常出現(xiàn)長鏈非編碼RNA(1ncRNAs)調(diào)控紊亂,這一現(xiàn)象在癌癥中尤為明顯。癌癥基因組的雜亂無章及不穩(wěn)定,主要表現(xiàn)為體細胞拷貝數(shù)變化(SCNAs),而這些體細胞拷貝數(shù)變化可能引發(fā)癌癥。大規(guī)模的基因組資料和全基因組功能篩查已經(jīng)成功地應用于識別引發(fā)癌癥的體細胞拷貝數(shù)變化位點。然而,蛋白編碼基因僅占人類基因組的2%,許多癌癥病灶的體細胞拷貝數(shù)變化位點不具有蛋白編碼功能。近年來,越來越多的證據(jù)也表明,人類大部分基因組具有轉(zhuǎn)錄活性,但僅有小部分是蛋白編碼基因,這些發(fā)現(xiàn)使人們認識到人類基因組包含了眾多長鏈非編碼RNA。此外,長鏈非編碼RNA在一系列不同類型的細胞和疾病中發(fā)揮著重要的作用,參與調(diào)控細胞的不同生物學進程,包括細胞周期、基因穩(wěn)定性及染色質(zhì)結構等,這表明長鏈非編碼RNA對細胞功能的調(diào)控幾乎無處不在。然而,大部分長鏈非編碼RNA的作用機制仍不清楚。因此,進一步探討長鏈非編碼RNA確切的作用機制及功能有助于我們了解其對人類癌癥的影響。小核仁RNA宿主基因3(SNHG3)是一種長鏈非編碼RNA,目前,它在肝癌中的潛在作用及機制尚未有報道。SNHG3,也稱為U17的宿主基因(U17HG),位于1號染色體短臂3區(qū)6號帶�；騼�(nèi)的U17小核仁RNA宿主基因最初由PelczarP發(fā)現(xiàn)。這位學者將人類和老鼠的U17HG進行對比,發(fā)現(xiàn)在兩個物種間小核仁RNA沒有蛋白編碼特性。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),在7對肝癌組織標本的芯片結果中,SNHG3在肝癌組織中的表達高于正常肝臟組織。然而,目前有關SNHG3作用的研究極少,其在肝癌中高表達是否暗含著重大的功能意義尚不清楚。本文的研究目的正是檢測肝癌中SNHG3的表達及其臨床意義。主要思路為：通過qRT-PCR方法檢測51對肝癌組織標本(隊列1)中SNHG3的表達,同時也用原位雜交的方法檢測144對石蠟包埋的肝癌組織標本(隊列2)中SNHG3的表達。然后,分析隊列2中SNHG3的表達和患者臨床病理特征間的關系。最后,使用COX回歸模型進行多因素分析,并結合SNHG3的表達與肝癌患者的總生存時間、無復發(fā)生存時間及無病生存時間的關系,明確SNHG3對肝癌患者的預后價值。研究內(nèi)容一.方法1.組織樣本和患者數(shù)據(jù)所有樣本的獲取符合南方醫(yī)科大學,南方醫(yī)院倫理委員會的協(xié)議,參與到本研究的肝癌患者均已簽署知情同意書。本研究納入了來自兩個獨立隊列的共計195位肝癌患者,在隊列1中,51對新鮮肝癌組織標本來自2011年1月至2012年7月期間在我院進行首次肝癌手術切除的患者,標本在RNA提取前儲存在-80℃的液氮中。在隊列2中,144對石蠟包埋的肝癌組織標本來自2006年1月份至2009年7月份期間在我院進行首次肝癌手術切除的患者。所有這些標本收集前均未進行任何抗腫瘤治療,包括放療、化療和手術,研究中對納入的肝癌組織樣本隨機選擇,對隊列2的患者進行5年的隨訪,所有患者的臨床資料將在下文中進行說明(表2-1和表2-2)。本研究按照Edmonson和Steiner建議的標準明確腫瘤分化,按照巴塞羅那臨床肝癌分期標準定義腫瘤分期。2.提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR使用TRIzol(？)試劑(Invitrogen,卡爾斯巴德,美國)提取組織樣本中的總RNA并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara生物技術,大連,中國)逆轉(zhuǎn)錄成cDNAc qRT-PCR按照Takara生物技術生產(chǎn)的SYBR(？) Green PCR試劑盒(Takara,大連,中國)的使用說明進行操作。SNHG3擴增的條件為：95℃預變性30秒,隨后,95℃,5秒,60℃,34秒,共40個循環(huán)。所有qRT-PCR的引物特異性和效率性均經(jīng)過檢驗。使用2-ΔΔCt相對定量方法計算倍數(shù)變化。3.原位雜交按照原位雜交試劑盒(Boster Bio-Engineering公司,武漢,中國)的使用說明進行SNHG3原位雜交檢測。片子分別由兩位病理專家在顯微鏡下根據(jù)SNHG3陽性細胞的染色強度及比例進行評分。染色強度按照以下的評分標準進行定義：0(陰性),1(弱陽性),2(中等陽性),3(強陽性)。染色比例評分：0(0%),1(1%-25%),2(26%-50%),3(51%-75%),4(76%-100%)。SNHG3表達的最終評分按照染色強度分值+染色比例分值進行計算,總分為0-7分�？偡种�3分或者更高為高表達組(陽性組)。4. TCGA數(shù)據(jù)庫為了明確SNHG3在肝癌中的表達,本研究使用的RNA測序方法分析來自The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://tcga-data.nci.Nih. gov/tcga/)的肝癌隊列�？偣灿�401例樣本具有SNHG3表達值,其中50例是正常的肝臟組織,351例是肝癌組織。收集每例樣本中SNHG3的表達值,并在肝癌組織標本和正常肝臟組織標本中對比SNHG3的表達水平。5. Oncomine數(shù)據(jù)庫在Oncomine Compendium of Expression Array data (www.oncomine.org)下載了一組Wurmbach Liver的芯片結果。使用Affymetrix U133 Plus 2.0基因芯片分析45例肝臟組織樣本,包括35例肝癌組織樣本和10例正常組織樣本,在肝癌組織樣本和正常組織樣本中對比SNHG3的表達水平。該芯片數(shù)據(jù)結果可在UCSC上查詢,檢索號為AJ006835。6.統(tǒng)計學分析本研究中的統(tǒng)計學分析均使用SPSS軟件(Abbott Laboratories, Chicago, IL)來進行,利用生存分析和Log-rank test來檢測生存曲線,通過單因素和多因素Cox回歸模型來評估影響生存的因素,利用單因素分析明確具有統(tǒng)計學差異的因素,再進一步通過多因素分析來評估它們對肝癌預后的獨立影響價值。SNHG3的表達和臨床病理特征間的關系通過The Mann-Whitney U-test進行檢驗,實時熒光定量和數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)通過Student's t-test進行分析。當P0.05時,認為具有統(tǒng)計學差異。二.結果1.SNHG3轉(zhuǎn)錄本在肝癌細胞株和肝癌組織中的表達通過實時熒光定量PCR方法檢測肝癌細胞株中SNHG3轉(zhuǎn)錄本的表達,長度為2238bp的轉(zhuǎn)錄本在所有6株肝癌細胞株中表達量最高,而長度為2346bp的轉(zhuǎn)錄本則幾乎檢測不到或低表達。在4對肝癌組織標本中用實時熒光定量PCR檢測這兩個轉(zhuǎn)錄本的表達,也得到一致的結論。2.SNHG3在肝癌組織中高表達用實時熒光定量PCR的方法檢測來自51位肝癌患者的肝癌組織標本中SNHG3的表達,相比正常的肝臟組織標本,SNHG3在肝癌組織標本中的表達升高5倍。此外,來自Oncomine數(shù)據(jù)庫(接收號AJ006835,Wurmbach,2007)的Wurmbach Liver芯片結果和TCGA數(shù)據(jù)集表明SNHG3在肝癌組織中的表達明顯高于正常組織。為了進一步明確以上結果,通過原位雜交的方法檢測144對石蠟包埋的肝癌組織標本中(隊列2)SNHG3的表達,與正常組織相比,SNHG3在91(63.2%)例肝癌組織中的表達明顯升高。3. SNHG3與肝癌患者臨床病理特征間的關系通過對144位肝癌患者中SNHG3的表達和臨床病理特征間的關系進行分析發(fā)現(xiàn)：SNHG3的表達與腫瘤大小、門靜脈癌栓和復發(fā)相關。然而,SNHG3表達與患者性別、年齡、肝硬化、BCLC分期無關。4. SNHG3過表達是肝癌患者預后獨立的不良因素通過生存分析和Log-rank分析發(fā)現(xiàn)：SNHG3的表達與肝癌患者的總生存率、無復發(fā)生存率和無病生存率呈負相關關系。此外,單因素分析預后因素表明SNHG3表達、門靜脈癌栓、復發(fā)、BCLC分期和腫瘤大小與總生存時間明顯相關。使用Cox回歸分析模型進行多因素分析表明SNHG3是肝癌患者預后的獨立影響因素。三.結論1.與正常肝臟組織相比,SNHG3在肝癌組織中明顯高表達。2.SNHG3表達與腫瘤大小、門靜脈癌栓和復發(fā)呈正相關。3.SNHG3高表達的肝癌患者相比SNHG3氏表達者預后差。4.SNHG3可以作為肝癌患者預后的獨立影響因子。
【關鍵詞】：長鏈非編碼RNA SNHG3 肝細胞癌 預后 腫瘤發(fā)生
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-23
• 參考文獻19-23
• 第一章 SNHG3的剪切體在肝癌細胞株和肝癌中的表達23-40
• 1.1 材料和方法23-29
• 1.2 結果29-34
• 1.3 討論34-36
• 參考文獻36-40
• 第二章 SNHG3在肝癌組織中的表達40-54
• 2.1 材料和方法40-46
• 2.2 結果46-48
• 2.3 討論48-50
• 參考文獻50-54
• 第三章 SNHG3與肝癌患者臨床病理特征的關系及對肝癌患者預后的影響54-61
• 3.1 材料和方法54-55
• 3.2 結果55-58
• 3.3 討論58-59
• 參考文獻59-61
• 全文總結61-62
• 4.1 主要發(fā)現(xiàn)61
• 4.2 不足和展望61-62
• 綜述62-75
• 參考文獻68-75
• 攻讀碩士學位期間成果75-76
• 致謝76-78

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