本文關(guān)鍵詞：Notch1通過調(diào)節(jié)PDGF-BB參與調(diào)控上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一[1],其中以上皮性腫瘤發(fā)生最常見,約占卵巢惡性腫瘤的70%,女性惡性腫瘤的第六位,癌癥相關(guān)死亡原因的第五位[2]它具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點,由于大多數(shù)患者早期無明顯癥狀,75%患者確診已到中晚期,故其死亡率位居女性生殖器惡性腫瘤首位[3]。在過去的很長一段時間里,隨著現(xiàn)代檢測及治療手段的改進,卵巢癌治療取得了長足進展,對于卵巢癌的治療采取了手術(shù)聯(lián)合化療及最新的卵巢癌新輔助化療的技術(shù)進步,但卵巢癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和死亡率仍然很高[4-5],由于其較高的轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率,總體預(yù)后依舊較差,五年生存率也僅為30%-40%。因此,積極尋找一種早期準確預(yù)測卵巢癌惡性程度及預(yù)后的指標,以便更加早期快速的診斷和早期對疾病進行干預(yù)是目前研究的熱點。既往研究表明:Notch1與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),它參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展[6]。在乳腺癌[7]、結(jié)直腸癌等多種組織中,Notch1表達均高于癌旁組織及正常組織。在胃癌組織中,Notch1與遠處轉(zhuǎn)移相關(guān),它可以通過環(huán)氧化和酶-2促進癌巢形成[8]。在胰腺癌中,Notch1活化核因子λB信號通路,釋放VEGF和基質(zhì)金屬蛋白酶促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移[9]。PDGF-BB具有促進細胞分裂增殖、細胞趨化、血管收縮等生物效應(yīng),是決定腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的重要因素。PDGF-BB是PDGF家族中的一個重要組成部分,是重要的血管生成因子。它通過與PDGFR結(jié)合誘導其酪氨酸激酶磷酸化,促進新生血管的形成,導致腫瘤生長[10]。許多惡性腫瘤如:乳腺癌、前列腺癌等組織中存在PDGF及其受體的高表達,對腫瘤的發(fā)展起著推動作用[11]。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中,多種環(huán)境及細胞因素都可對PDGF進行誘導,使其表達增加,缺氧條件下,血管生成刺激因子如VEGF、PDGF會立刻被釋放,促進血管生成并對腫瘤組織加速供氧[12]。此外,突變的癌基因和抑癌基因也可誘導PDGF的激活和過表達[13]。目前對于Notch1信號通路在多種腫瘤中研究均較多,而PDGF-BB對于惡性腫瘤的血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移方面的影響有直接關(guān)系,二者是否對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有著遞進的關(guān)系且二者是否存在相關(guān)性有待進一步實驗證明。本研究針對以上問題逐步展開,報道Notch1和PDGF-BB在卵巢癌組織中的表達情況,通過研究Notch1和PDGF-BB在臨床病理資料的相關(guān)性,報道了Notch1和PDGF-BB與臨床病理的密切關(guān)系及二者在卵巢癌組織中的表達的線性關(guān)系。我們在卵巢癌細胞系中進一步證實了Notch1和PDGF-BB的生物學功能,初步評估了Notch1與PDGF-BB在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)聯(lián)性,對于未來臨床中卵巢癌的早期診斷提供了新的思路。目的1.Notch1和PDGF-BB在卵巢癌組織中的表達及相關(guān)性分析;2.下調(diào)Notch1在卵巢癌細胞中的表達及其侵襲轉(zhuǎn)移的影響;3.下調(diào)Notch1在卵巢癌中的表達對其生存能力及凋亡的影響;4.下調(diào)Notch1,驗證PDGF-BB在卵巢癌細胞中的表達;5.下調(diào)PDGF-BB在卵巢癌細胞中的表達及其侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法1.Notch1和PDGF-BB在卵巢癌組織中的表達與其臨床病理的相關(guān)性分析。a)運用免疫組織化學技術(shù)分析Notch1和PDGF-BB在60例上皮性卵巢癌和10例正常卵巢石蠟標本組織中的表達;b)應(yīng)用spss17.0統(tǒng)計軟件進行分析,進行卡方檢驗及求Spearman相關(guān)系數(shù)。2.應(yīng)用RT-PCR和Western-blot分別分析四種卵巢癌細胞中Notch1的基因表達和蛋白表達情況,Transwell法檢測四種卵巢癌細胞的侵襲遷移能力。Notch1 si RNA分別轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM和低轉(zhuǎn)移株卵巢癌細胞株HO-8910,觀察轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞株的Notch1的基因和蛋白表達情況,Transwell法檢測轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞的生物學功能并對穿膜細胞進行計數(shù)分析。3.Notch1 si RNA分別轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM和低轉(zhuǎn)移株卵巢癌細胞株HO-8910,用MTT法及酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值反應(yīng)細胞生存能力,用AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。4.Notch1 si RNA分別轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM和低轉(zhuǎn)移株卵巢癌細胞株HO-8910,觀察轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞株的PDGF-BB基因表達情況,Notch1和PDGF-BB蛋白表達情況,ELISA法檢測PDGF-BB在細胞上清中的濃度。5.PDGF-BB siRNA分別轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM和低轉(zhuǎn)移株卵巢癌細胞株HO-8910,觀察轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞株的PDGF-BB蛋白表達情況。Transwell法檢測轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞的生物學功能并對細胞進行計數(shù)分析。結(jié)果1.觀察Notch1和PDGF-BB在卵巢癌組織中的表達情況及臨床病理的相關(guān)性分析。a)卵巢癌組織中可見Notch1和PDGF-BB表達;b)Notch1陽性染色主要位于細胞膜中,細胞核、細胞漿也有部分表達。在卵巢癌組織中,63%(38/60)高表達,37%(22/60)低表達;在10例正常卵巢組織中,部分染色顯示高表達20%(2/10),其余均為低表達;c)PDGF-BB陽性染色主要位于細胞漿中。在卵巢癌組織中,60%(36/60)高表達;40%(24/60)低表達。在正常卵巢組織中,部分染色顯示高表達10%(1/10),其余均為低表達;d)PDGF-BB與Notch1表達水平與卵巢癌的FIGO分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P0.05),Notch1與卵巢癌患者年齡、組織類型無關(guān)(P0.05),PDGF-BB與患者年齡無關(guān)(P0.05),與組織類型相關(guān)(P0.05);e)Spearman相關(guān)性分析顯示:PDGF-BB表達與Notch1的表達呈正相關(guān)(r=0.696,P0.01)。2.下調(diào)Notch1在卵巢癌細胞中的表達,觀察卵巢癌細胞的生物學效應(yīng)分析。a)RT-PCR和Western-blot分別對HO-8910PM,SKVO3,3AO和HO-8910四種卵巢癌細胞中Notch1的基因表達和蛋白表達情況進行檢測,HO-8910PM卵巢癌細胞基因表達及蛋白表達均最高,HO-8910卵巢癌細胞二者均低;b)HO-8910PM,SKVO3,3AO和HO-8910卵巢癌細胞侵襲和遷移穿膜細胞統(tǒng)計顯示:侵襲組和遷移組HO-8910PM細胞數(shù)較多,說明其侵襲遷移能力較強,侵襲組和遷移組HO-8910細胞數(shù)較少,說明其侵襲遷移能力較弱;c)對高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM和低轉(zhuǎn)移株卵巢癌細胞株HO-8910轉(zhuǎn)染Notch1 si RNA后,RT-PCR檢測Notch1轉(zhuǎn)染組基因表達水平均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組,Western-blot分析Notch1轉(zhuǎn)染組蛋白表達均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組,Transwell法檢測HO-8910PM和HO-8910卵巢癌細胞侵襲和遷移能力,對其細胞計數(shù)表明Notch1轉(zhuǎn)染組穿膜細胞計數(shù)均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05)。3.下調(diào)Notch1在卵巢癌細胞中的表達,對其細胞生存能力及細胞凋亡的影響評估。a)用MTT法檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染Notch1si RNA的卵巢癌細胞490nm波長處測定其光吸收值顯示,轉(zhuǎn)染組與對照組和未轉(zhuǎn)染組比較,無明顯差異(P0.05);b)用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果:轉(zhuǎn)染組與對照組、未轉(zhuǎn)染組比較,無明顯差異(P0.05)。4.對高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM和低轉(zhuǎn)移株卵巢癌細胞株HO-8910轉(zhuǎn)染Notch1si RNA后,RT-PCR分析PDGF-BB在細胞中的基因表達水平均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組。Western-blot分析卵巢癌細胞中Notch1和PDGF-BB的蛋白表達均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組,ELISA分析卵巢癌細胞中PDGF-BB細胞上清濃度均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.對高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM和低轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910轉(zhuǎn)染PDGF-BB si RNA后,Western-blot分析PDGF-BB轉(zhuǎn)染組蛋白表達均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組。Transwell法檢測HO-8910PM和HO-8910卵巢癌細胞侵襲和遷移能力,對其穿膜細胞計數(shù)表明PDGF-BB轉(zhuǎn)染組均低于對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05)。結(jié)論1.本實驗確定了Notch1和PDGF-BB在卵巢癌組織和細胞中表達情況。證明了Notch1和PDGF-BB在卵巢癌組織中均為高表達且而二者具有線性相關(guān)性,證明二者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中有著共同的信號通路。2.發(fā)現(xiàn)PDGF-BB與Notch1表達水平與卵巢癌的FIGO分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),PDGF-BB還與卵巢癌病理分型相關(guān),二者均與年齡無關(guān),證明了二者在卵巢癌惡性潛能中起著重要作用。3.下調(diào)Notch1可減弱卵巢癌細胞的侵襲遷移能力,并能同時減弱PDGF-BB的表達,但并不能對卵巢癌細胞的生存能力及凋亡產(chǎn)生明顯影響,證實了Notch1正性調(diào)控PDGF-BB,可能存在PDGF-BB陽性的卵巢癌細胞在Notch1通路作用下,過度促進新生血管形成,從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 Notch1 PDGF-BB 侵襲 轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-19
• 文獻回顧19-27
• 第一部分Notch1和PDGF-BB在卵巢癌組織中的表達與其臨床病理的相關(guān)性分析27-35
• 1 材料27-28
• 2 方法28-29
• 3 結(jié)果29-33
• 4 討論33-35
• 第二部分 下調(diào)Notch1對卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響35-55
• 1 材料35-38
• 2 方法38-47
• 3 結(jié)果47-52
• 4 討論52-55
• 第三部分Notch1通過調(diào)節(jié)PDGF-BB的表達影響卵巢癌細胞的侵襲遷移能力55-64
• 1 材料55-56
• 2 方法56-58
• 3 結(jié)果58-62
• 4 討論62-64
• 小結(jié)64-66
• 參考文獻66-75
• 個人簡歷和研究成果75-77
• 致謝77

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