本文關鍵詞：KLF4在氧化苦參堿抑制結腸癌細胞增殖中的作用及機制研究

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【摘要】：結腸癌(Colon cancer)是世界范圍內常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,在我國,目前已經成為發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一,嚴重威脅著人們的生命健康。然而,結腸癌的具體發(fā)病機制尚不明確,探求其發(fā)生發(fā)展機制和有效的治療藥物對于指導科研和臨床具有重要意義。氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT),分子式為C15H24N2O,屬于四環(huán)類喹諾里西啶生物堿(quinolizidine),是從中藥苦參(Sophora flavescens A it)、苦豆子(S.Alopecuroides L)及廣豆根(S.Subprostrata Chun etT.Chen)中提取與分離的一種中藥單體,具有廣泛的藥理學作用和生物學活性,如抑制病毒生長、抑制炎癥因子作用、保肝、扭轉心律失常、增強和調節(jié)免疫功能及降低纖維化等作用。尤其是近年來,OMT的抗癌特性受到人們廣泛的關注,有報道,其對肝癌、胃腸癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、視網膜母細胞瘤及白血病等多種惡性腫瘤表現(xiàn)出生長負向作用�，F(xiàn)有研究證據(jù)發(fā)現(xiàn),OMT具有抑制惡性腫瘤細胞增殖、誘導惡性腫瘤細胞周期停滯、抗腫瘤周圍血管形成、誘導癌細胞向正常細胞分化、促進癌細胞凋亡、抑制癌細胞侵襲及遷移等作用。特別在結腸癌相關實驗中發(fā)現(xiàn),OMT可抑制HT-29、SW1116、LOVO等多種結腸癌細胞增殖,誘導腫瘤細胞凋亡。KLF4(Krüpple like factor 4)屬于鋅指型轉錄因子的家族,參與調控正常細胞生長、增殖、分化、凋亡、代謝及維持正常組織的穩(wěn)態(tài),同時也與惡性腫瘤的發(fā)生機制有著非常緊密的聯(lián)系。研究表明,KLF4在胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中低表達,可能表現(xiàn)為抑癌作用,但在原發(fā)性乳腺導管癌、前列腺癌、口腔鱗癌等呈現(xiàn)高表達水平,可能表現(xiàn)為促癌作用。因此人們認為KLF4具有正負雙向調節(jié)作用,與多種靶基因結合,產生不同作用,可以表現(xiàn)激活或抑制轉錄,故KLF4在不同類型的癌組織中,呈現(xiàn)出癌基因和抑癌基因的不同屬性。目前研究已證明KLF4能夠抑制多種惡性癌細胞增殖、遷徙及侵襲,特別是在結腸癌RKO細胞中,質粒轉染KLF4基因使其高表達后,發(fā)現(xiàn)細胞內p21基因表達增多,并且阻滯G1/S細胞周期。進一步研究發(fā)現(xiàn),γ射線照射結腸癌hct116細胞后,若klf4基因存在,可以抑制中心體擴增從而抑制腫瘤細胞的增殖,如果klf4基因表達呈現(xiàn)缺失,將導致染色體呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)�，F(xiàn)有的實驗證據(jù)表明,klf4在消化道上皮是一個重要的抑癌基因,然而klf4是否參與抑制結腸癌細胞增殖及其分子機理尚不完全明確。本實驗系統(tǒng)地研究klf4在結腸癌組織中的表達水平、探求omt對結腸癌細胞增殖的影響及klf4在其中發(fā)揮作用的機制,使進一步探求結腸癌的治療靶標獲得理論依據(jù)。目的:探討結腸癌及癌旁組織臨床樣本中klf4表達水平。探討omt對結腸癌細胞中klf4表達的影響。探討klf4在omt抑制結腸癌細胞增殖過程中產生的效應。方法:1收集結腸癌組織和相應的癌旁組織各30例,分別經由rt-pcr及western-blot方法檢測klf4mrna及蛋白表達情況,反應結腸癌組織及癌旁組織中klf4的表達水平。2培養(yǎng)結腸癌ht-29細胞株,配制不同濃度的omt的培養(yǎng)液藥物處理結腸癌細胞,并建立空白對照,從中提取rna及蛋白,分別使用rt-pcr和western-blot方法,檢測標本中klf4mrna及蛋白表達情況,以此反應omt對結腸癌細胞中klf4表達的影響。3利用klf4sirna瞬時轉染經過omt處理的結腸癌ht-29細胞株,下調細胞中klf4基因的表達,培養(yǎng)沉默表達klf4的結腸癌細胞株,mtt實驗方法檢測細胞增殖的能力。結果:1結腸癌及癌旁組織中klf4表達水平采用rt-pcr及western-blot方法檢測結腸癌及癌旁組織中klf4的表達。結果顯示,結腸癌組織中klf4mrna及蛋白水平均明顯低于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2omt對結腸癌細胞中klf4表達的影響采用rt-pcr及western-blot方法檢測用含有不同濃度omt細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的結腸癌ht-29細胞株中klf4的表達。結果顯示,隨著omt濃度的增加,KLF4 mRNA及蛋白水平明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結果表明OMT可明顯誘導細胞中KLF4表達。3 KLF4在OMT抑制結腸癌細胞增殖過程中產生的效應利用KLF4 siRNA(KLF4特異性小干擾RNA)轉染結腸癌HT-29細胞株,敲減細胞內KLF4的表達,再觀察OMT對結腸癌細胞增殖的影響。結果顯示,敲減KLF4后,結腸癌細胞增殖能力增強,OMT抑制結腸癌細胞增殖的作用明顯減弱,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明KLF4介導了OMT抑制結腸癌HT-29細胞增殖過程。結論:1在結腸癌中,KLF4蛋白的表達低于癌旁組織,KLF4可能對結腸癌的表現(xiàn)為負向調控作用,是結腸癌的抑癌基因。2 OMT在結腸癌中促進KLF4基因的表達,OMT對結腸癌的發(fā)生可能具有抑制作用。3沉默KLF4后,OMT抑制結腸癌增殖的作用明顯下降,OMT可能是通過KLF4這個關鍵基因來實現(xiàn)其抑制結腸癌增殖的效應。
【關鍵詞】：結腸癌 氧化苦參堿 KLF4 蛋白印跡法 RT-PCR MTT 增殖
【學位授予單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-23
• 結果23-25
• 附圖25-30
• 討論30-34
• 結論34-35
• 參考文獻35-43
• 綜述43-53
• 參考文獻48-53
• 致謝53-54
• 個人簡歷54

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本文編號：1049016