本文關鍵詞：電針刺激聯(lián)合BMSCs移植治療對腦出血大鼠腦組織內AQP-4、AQP-9及MMP-9蛋白表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《瀘州醫(yī)學院》 2013年

電針刺激聯(lián)合BMSCs移植治療對腦出血大鼠腦組織內AQP-4、AQP-9及MMP-9蛋白表達的影響

范光碧  

【摘要】：目的：電針刺激聯(lián)合骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stemcells, BMSCs)移植治療腦出血(Intracerebral Hemorrhage, ICH)大鼠，觀察出血灶周邊腦區(qū)腦水腫相關蛋白水通道蛋白4（aquaporins-4，AQP-4）、水通道蛋白9（aquaporins-9， AQP-9）、基質金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）的表達變化，探討通過聯(lián)合治療能否促進腦出血大鼠出血灶周邊腦區(qū)水轉運，減輕腦水腫，改善神經(jīng)缺失癥狀。方法：1.建立腦出血大鼠模型：利用腦立體定位儀向SD大鼠右側尾狀核區(qū)注射肝素+Ⅰ型膠原酶誘導腦出血模型，于術后2h、24h、48h進行三次神經(jīng)損害程度評分（Neurological severity score，NSS評分），任意一次評分大于9分者入選實驗組。2.培養(yǎng)骨髓間充質干細胞（BMSCs）：將冷凍保存并已作GFP標記的BMSCs進行復蘇、傳代，當生長至細胞融合度為80%左右時，換預誘導液誘導24h，于移植前6h改用無血清誘導液誘導，移植時收集細胞，調整細胞濃度至2.5×107個/ml用于移植。3.實驗動物分組：生理鹽水組(Control組)，造模后第3d沿相同手術入路向右側尾狀核區(qū)注入生理鹽水20μl；細胞移植組(BMSCs組)，造模后第3d往出血灶內移植BMSCs20μl；電針治療組（electro-acupuncture therapy，Ea組），造模后第3d開始以連續(xù)波、頻率3Hz、強度1V的電針刺激大鼠百會穴和大椎穴，每天1次直至處死動物；電針刺激聯(lián)合細胞移植組（electro-acupuncture combinedwith BMSCs transplantation,Ea-BMSCs組），造模后第3天往出血灶移植BMSCs20μl，細胞移植后2h開始電針刺激，之后同電針治療組處理方法一致。4.按分組后喂養(yǎng)的時間不同將各組動物再分為1d、3d、5d、7d及14d5個亞組，在相應時間點采血，收集血清，處死動物取出腦組織。5.采用免疫組化SABC法觀察AQP-4、AQP-9及MMP-9在腦組織中的分布；Western-blotting檢測AQP-4在出血灶周邊腦區(qū)的表達變化；干濕法檢測出血灶周邊腦組織水含量；放射免疫法（RIA）測定血清中白細胞介素2（Interleukin-2，IL-2）的含量。結果：1.出血灶周邊腦組織水含量：①各組模型腦組織水含量在第3d開始升高，第5d達到峰值。②Ea組各時間點腦組織水含量均低于其余各組（p＜0.05）。③Ea-BMSCs組只有5d、7d組腦組織水含量低于Control組（p＜0.05）。④Ea-BMSCs組與BMSCs組之間比較未見統(tǒng)計差異。2.出血灶周邊區(qū)腦組織AQP-4的表達變化：（1）免疫熒光雙標顯示，AQP-4陽性物質表達于出血灶周邊腦區(qū)膠質酸性纖維蛋白（GFAP）陽性細胞上。（2）免疫組化檢測出血灶周邊腦區(qū)AQP-4陽性產(chǎn)物的OD值（平均光密度值）：①Control組、BMSCs組和Ea BMSCs組AQP-4蛋白在第3d開始升高，于第5d達到峰值，BMSCs組和Ea-BMSCs組在第7d后再度升高，而Control組和Ea組在達峰值后未見升高。②Ea-BMSCs組和BMSCs組在第1d、5d蛋白表達均低于Control組（p＜0.05），在第14d表達卻高于Control組（p＜0.05），且Ea-BMSCs組第1d、5d的表達低于BMSCs組（p＜0.05），而第14d蛋白的表達與BMSCs組比較無統(tǒng)計學差異。（3）Western-blotting檢測出血灶周邊AQP-4陽性物質的灰度值：3.出血灶周邊區(qū)腦組織AQP-9的表達變化：免疫組化檢測出血灶周邊腦區(qū)AQP-9陽性產(chǎn)物OD值顯示，①Control組、BMSCs組和Ea-BMSCs組AQP-9蛋白在第1d開始升高，于第3d和7d第兩次達到峰值，而Ea組只于第7d達到峰值；②第3d，Ea-BMSCs組AQP-9表達高于Control組、BMSCs組和Ea組（p＜0.05），而BMSCs組與Control組和Ea組之間比較無統(tǒng)計學差異；③第7d，Ea組、Ea-BMSCs組和BMSCs組AQP-9表達均高于Control組（p＜0.05），Ea-BMSCs組AQP-9表達高于Ea組，且具有統(tǒng)計學差異（p＜0.05），但Ea-BMSCs組與BMSCs組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。4.出血灶周邊區(qū)腦組織MMP-9的表達變化：（1）免疫熒光檢測可見，MMP-9陽性產(chǎn)物主要表達于出血灶及周邊腦區(qū)，且隨著時間的推移，陽性表達產(chǎn)物逐漸減少。（2）免疫組化檢測出血灶周邊腦區(qū)MMP-9陽性產(chǎn)物OD值顯示，①Ea-BMSCs組和BMSCs組MMP-9表達于第1d開始升高，第3d達到峰值，之后緩慢下降，Ea-BMSCs組于第7d開始出現(xiàn)上升的趨勢。Control組和Ea組一直呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。②在第1d，Ea-BMSCs組和Ea組顯著低于BMSCs組和control組（p＜0.05），但Ea-BMSCs組和Ea組之間比較以及BMSCs組和control組之間比較，未見統(tǒng)計學差異。③在第3d，Ea-BMSCs組和Ea組MMP-9表達低于control組（p＜0.05），Ea-BMSCs組高于Ea組（p＜0.05）；BMSCs組高于control組（p＜0.05）。④在第14d，Ea-BMSCs組和BMSCs組MMP-9表達均高于control組（p＜0.05），Ea組低于control組（p＜0.05），但Ea-BMSCs組、BMSCs組組間比較未見統(tǒng)計學差異。5.血清IL-2含量：①在第1d，各組之間含量無差異；②從第3d開始，BMSCs組顯著高于其余各組（P＜0.05），而后迅速降低，于第5d與control組相近，隨后開始升高。③從第5d開始，Ea-BMSCs組IL-2表達才顯著高于control組和BMSCs組（P＜0.05），且該組IL-2的含量一直在較高水平上緩慢下降；④Ea組在第3d與其余各組比較出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），但從第5d開始高于移植組和control組（P＜0.05），于第14d顯著增高，與其余各組相比，P＜0.05。結論：1.電針聯(lián)合BMSCs移植可在腦出血急性期抑制AQP-4的表達，減輕局部腦水腫，急性期后可促進AQP-4表達上調，加快水的跨膜轉運，促進水腫消散。2.電針聯(lián)合BMSCs移植可在腦出血后期上調AQP-9的表達，加快腦水腫的消散和促進腦能量代謝的恢復。3.BMSCs移植治療早期可促進MMP-9的表達，加重腦水腫，BMSCs移植后輔以電針治療可降低MMP-9的表達，減輕移植排斥反應。4. BMSCs治療可引起血清IL-2含量顯著升高，推測BMSCs移植可能誘發(fā)移植物抗宿主反應，采用電針聯(lián)合BMSCs治療可降低血清IL-2水平，，減輕移植排斥反應。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R743.34;R245
【目錄】：

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