本文選題：電針　切入點(diǎn)：酒精性肝纖維化　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：電針結(jié)合人胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞移植對酒精性肝纖維化模型大鼠干預(yù)的研究研究目的 復(fù)制并改良持續(xù)酒精灌胃法制備酒精性肝纖維化模型大鼠,分別采用電針經(jīng)穴、筋膜并結(jié)合人胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞(human embryonic mesenchymal stem cells, hEMSCs)移植干預(yù),觀察分子生物學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化,比較電針經(jīng)穴、筋膜對hEMSCs在酒精性肝纖維化模型大鼠體內(nèi)靶向遷移軌跡的影響,綜合評價電針經(jīng)穴、筋膜結(jié)合hEMSCs移植對酒精性肝纖維化模型大鼠的療效及其差異,并通過模型大鼠血清、電針血清體外誘導(dǎo)培養(yǎng)hEMSCs,進(jìn)一步探討電針誘導(dǎo)hEMSCs分化的可能機(jī)制,初步闡明電針對干細(xì)胞移植抗肝纖維化治療具有促進(jìn)增效作用,為指導(dǎo)臨床開展針刺結(jié)合干細(xì)胞移植抗酒精性肝纖維化治療以及針灸與筋膜效應(yīng)差異的研究提供實(shí)驗與理論依據(jù)。 研究方法 1將102只健康雄性SD大鼠按體重隨機(jī)分為A(正常對照組)、B(模型組)、C(hEMSCs移植組)、D(電針期門+hEMSCs移植組)、E(電針期門穴區(qū)筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組)、F(電針陽陵泉+hEMSCs移植組)、G(電針陽陵泉穴區(qū)筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組)7組,采用改良的白酒—豬油(自制)—吡唑混懸液持續(xù)灌胃60d復(fù)制酒精性肝纖維化模型； 2含10%胎牛血清(FBS)的DMEM(低糖)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增hEMSCs至第6代細(xì)胞,采用重組腺病毒載體Ad5-EGFP轉(zhuǎn)染hEMSCs(感染復(fù)數(shù)為100)48h后,常規(guī)消化細(xì)胞并計數(shù),根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果加入PBS緩沖液,將已轉(zhuǎn)染的hEMSCs調(diào)成濃度為2×106cells/ml的單細(xì)胞懸液,于無菌條件下對C、D、E、F、G五組造模成功的大鼠進(jìn)行尾靜脈注射移植,0.5ml/只； 3 D、E、F、G四組(電針治療組)分別采用電針雙側(cè)期門穴、期門穴區(qū)筋膜密集區(qū)、陽陵泉穴、陽陵泉穴區(qū)筋膜密集區(qū),疏密波,頻率2/1 OOHz,強(qiáng)度0.1～0.2mA,以肢體微微顫動為度,留針20min,隔24h治療1次,共治療10次。同時A、B、C三組分別予以布袋束縛20min不針刺； 4觀察大鼠的體重變化及毛色、進(jìn)食、活動等一般情況,采用酶聯(lián)免疫分析(ELLSA)方法測定各組大鼠血清胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、Ⅳ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)的含量,采用激光共聚焦技術(shù)觀察肝組織冰凍切片Ad5-EGFP轉(zhuǎn)染的hEMSCs在酒精性肝纖維化模型大鼠體內(nèi)向肝臟靶向遷移的軌跡,肝組織常規(guī)石蠟切片行HE、天狼猩紅染色觀察膠原沉積情況及病理學(xué)變化,免疫組織化學(xué)法測定肝組織中TGF-p1、TNF-a的表達(dá)； 5通過酒精性肝纖維化模型大鼠血清及電針血清不同時間段誘導(dǎo)培養(yǎng)hEMSCs,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測不同血清干預(yù)誘導(dǎo)后甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、白蛋白(Albumin,ALB)及α-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)的基因表達(dá)。 研究結(jié)果 1正常對照組大鼠毛發(fā)光澤,體重增加,體態(tài)活潑,飲食及大、小便正常。模型組大鼠飲食逐漸減少,體重減少,大便干燥或不成形,氣味惡臭,小便黃,皮毛粗糙、疏松無光澤,脫毛明顯,精神萎靡不振,造模后狂躁易怒,有互相撕咬等好斗現(xiàn)象。電針各組大鼠治療后上述癥狀有不同程度改善。 2各組大鼠血清IGF-Ⅰ、Ⅳ型膠原、MMP-2、TIMP-1含量的變化 與正常組比較,模型組大鼠血清IGF-1、Ⅳ型膠原及MMP-2含量均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,P0.05,P0.01),hEMSCs移植組大鼠血清Ⅳ型膠原與MMP-2含量明顯升高、TIMP-1含量明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),電針陽陵泉穴筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組大鼠血清TIMP-1含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與模型組比較,hEMSCs移植組大鼠血清TIMP-1含量降低顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),電針期門穴筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組大鼠血清IGF-1含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),電針陽陵泉穴+hEMSCs移植組大鼠血清Ⅳ型膠原含量降低顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),電針陽陵泉穴筋膜密集區(qū)十hEMSCs移植組大鼠血清IGF-1、MMP-2、TIMP-1含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,P0.05,P0.01)；與hEMSCs移植組比較,電針期門穴+hEMSCs移植組大鼠血清Ⅳ型膠原含量明顯降低、TIMP-1含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),電針期門穴筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組大鼠血清IGF-1、Ⅳ型膠原、MMP-2含量均降低明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,P0.01,P0.05),電針陽陵泉穴+hEMSCs移植組與陽陵泉穴筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組大鼠血清Ⅳ型膠原、MMP-2含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與電針期門穴+hEMSCs移植組比較,電針陽陵泉穴筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組大鼠血清TIMP-1含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。電針各組大鼠血清IGF-1、Ⅳ型膠原、MMP-2含量比較則均未見顯著變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3攜帶Ad5-EGFP基因的hEMSCs在酒精性肝纖維化模型大鼠體內(nèi)向肝臟靶向遷移的情況 相同視野下,hEMSCs移植組大鼠肝組織可見極少量綠色熒光,而電針各組大鼠肝內(nèi)亦可見散在綠色熒光,但較單純hEMSCs移植組內(nèi)的分布增多。腎中均未見分布。 4 HE染色顯示：正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索排列整齊,呈放射狀,肝竇規(guī)則,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,胞質(zhì)散見脂滴；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂或不完整,肝細(xì)胞腫脹、重度脂肪變性、中央靜脈周圍膠原纖維增生,匯管區(qū)纖維隔增寬；各治療組肝組織變性、壞死較模型組有所減輕,膠原纖維增生減少,部分肝小葉結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。天狼猩紅染色顯示,與正常組比較,模型組大鼠肝組織膠原沉積面積明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與模型組比較,電針期門穴筋膜密集區(qū)+hEMSCs移植組與陽陵泉穴+hEMSCs移植組大鼠肝組織膠原沉積均顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),余未見統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5免疫組化結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組、hEMSCs移植組與電針各組大鼠肝組織TGF-p1、TNF-a陽性細(xì)胞表達(dá)均有所增加(P0.05)；與模型組比較,hEMSCs移植組與電針各組大鼠肝組織TGF-p1、TNF-a陽性細(xì)胞表達(dá)均有所減少(P0.05)；與hEMSCs移植組比較,電針各組大鼠肝組織TGF-p1、TNF-a陽性細(xì)胞表達(dá)均呈現(xiàn)一定程度的減少(P0.05)。電針各組間比較,大鼠肝組織TGF-p1、TNF-a陽性細(xì)胞表達(dá)分別表現(xiàn)為一定程度的減少或增加(P0.05)。 6 RT-PCR檢測結(jié)果顯示,培養(yǎng)24h時,各誘導(dǎo)組細(xì)胞均未見AFPmRNA、ALBmRNA及a-SMA mRNA表達(dá)；培養(yǎng)5d時,除針刺陽陵泉筋膜鼠血清組外各誘導(dǎo)組AFPmRNA表達(dá)均呈陽性,且酒精性肝纖維化模型鼠血清組與針刺陽陵泉穴鼠血清組少許細(xì)胞呈a-SMA mRNA弱陽性,針刺期門筋膜鼠血清組與針刺陽陵泉穴鼠血清組有少數(shù)細(xì)胞呈ALBmRNA陽性；隨培養(yǎng)時間延長,除針刺陽陵泉筋膜鼠血清組在培養(yǎng)14d部分細(xì)胞呈AFPmRNA陽性,余各誘導(dǎo)組AFPmRNA表達(dá)逐漸減弱,ALBmRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)。整個培養(yǎng)過程對照組細(xì)胞AFPmRNA、ALBmRNA及a-SMA mRNA表達(dá)呈陰性。 研究結(jié)論 1改良后的白酒—豬油(自制)—吡唑混懸液持續(xù)灌胃法可使大鼠肝組織較快出現(xiàn)重度脂肪變,進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生,發(fā)病過程與人類酒精性肝纖維化發(fā)病過程相似,且模型制備時間縮短,模型成活率較高,方法簡便易行； 2 hEMSCs移植對酒精性肝纖維化具有一定的改善作用,其機(jī)制可能與hEMSCs移植進(jìn)入酒精性肝纖維化模型大鼠體內(nèi)后受內(nèi)環(huán)境影響部分細(xì)胞向肝臟定向遷移分化,并有效降低了肝纖維化模型大鼠血清TIMP-1含量,一定程度上減少了TGF-p1、TNF-a在肝纖維化模型大鼠肝組織中的高表達(dá)有關(guān)。 3電針結(jié)合hEMSCs移植具有明顯的抗肝纖維化作用,其療效的產(chǎn)生可能是通過降低酒精性肝纖維化模型大鼠血清中升高的IGF-Ⅰ、Ⅳ型膠原、MMP-2、TIMP-1含量,改善肝纖維化導(dǎo)致的肝細(xì)胞變性、壞死程度,抑制膠原纖維增生及病變肝組織中TGF-β1、TNF-a的高表達(dá),同時電針在一定程度上還促進(jìn)了hEMSCs向病變肝組織的靶向遷移、分化而實(shí)現(xiàn)的。推測其機(jī)制可能與電針在一定條件下改變了病變局部的微環(huán)境,使其向著有利于干細(xì)胞向病損組織靶向遷移、分化的方向發(fā)展有關(guān)。這個一定條件包括實(shí)驗中所涉及的針刺穴位選擇、電針強(qiáng)度、電針頻率等。 4電針不同經(jīng)穴、不同經(jīng)穴筋膜密集區(qū)療效不同：陽陵泉穴的療效期門穴,陽陵泉穴區(qū)筋膜密集區(qū)與期門穴區(qū)筋膜密集區(qū)療效無明顯差異；期門穴區(qū)筋膜密集區(qū)的療效期門穴,陽陵泉穴的療效陽陵泉穴區(qū)筋膜密集區(qū)。 5酒精性肝纖維化病理模型血清和電針血清均能夠誘導(dǎo)hEMSCs分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞,并表達(dá)肝細(xì)胞的特異性標(biāo)志物AFP、ALB,且電針血清誘導(dǎo)hEMSCs分化的速度較快、肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)更強(qiáng),推測模型血清及電針血清中可能存在誘導(dǎo)hEMSCs分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的相關(guān)因子,且針刺可能為hEMSCs向肝細(xì)胞分化提供了更適宜的誘導(dǎo)環(huán)境,縮短了hEMSCs向肝細(xì)胞分化的時間,進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用的。且針刺期門穴區(qū)筋膜密集區(qū)組與陽陵泉穴組誘導(dǎo)效果最明顯。 綜上所述,本研究結(jié)果對今后臨床開展針刺結(jié)合干細(xì)胞移植治療酒精性肝纖維化患者具有重要的指導(dǎo)意義,并為針灸的筋膜學(xué)基礎(chǔ)研究提供了寶貴的實(shí)驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R245;R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1600021