目的:通過(guò)觀察何首烏飲對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞DNMTs活性的影響,探討何首烏飲調(diào)控大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老的甲基化機(jī)制。方法:1.差異貼壁法分離培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞,采用3β-HSD特異性染色,鑒定睪丸間質(zhì)細(xì)胞純度。2.采用氧化損傷方法建立細(xì)胞衰老模型,通過(guò)檢測(cè)β-半乳糖苷酶表達(dá)水平,細(xì)胞周期和P16蛋白表達(dá)情況,判斷衰老模型是否構(gòu)建成功。3.采用構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞,將間質(zhì)細(xì)胞中DNMT1基因敲低。4.通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,熒光定量PCR檢測(cè)DNMT1 mRNA的表達(dá)水平,篩選出DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑最適濃度和最佳作用時(shí)間。5.依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募?xì)胞分組為:正常組、衰老組、何首烏飲組、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與何首烏飲共孵育組、DNMT1敲低組、DNMT1敲低與何首烏飲共孵育組、陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。6.采用免疫熒光技術(shù),檢測(cè)P16蛋白的表達(dá)情況。7.采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測(cè)各組表觀遺傳基因wnt2b和C-myb的啟動(dòng)子甲基化水平。結(jié)果:1.間質(zhì)細(xì)胞衰老模型鑒定及細(xì)胞衰老對(duì)DNMT1表達(dá)影響:300μM H₂O₂...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖2-1睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD染色（標(biāo)尺：A=100μm，B=50μm，C=20μm）

圖2-1睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD染色（標(biāo)尺：A=100μm，B=50μm，C=20μm）.2細(xì)胞衰老模型的鑒定及衰老細(xì)胞DNMT1mRNA表達(dá)變化運(yùn)用氧化損傷的方法誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老，進(jìn)行衰老相關(guān)特異性β-半

圖2-2間質(zhì)細(xì)胞β-半乳糖苷酶衰老染色結(jié)果

ABCD圖2-2間質(zhì)細(xì)胞β-半乳糖苷酶衰老染色結(jié)果A、B為正常組；C、D為衰老組（A、C標(biāo)志=100μm；B、D標(biāo)尺=50μm）β-半乳糖苷酶衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)綠色，定位于細(xì)胞質(zhì)表2-9β-半乳糖苷酶細(xì)胞陽(yáng)性率的比較（x±s）組別β-半乳糖苷酶陽(yáng)性率正常組1....

圖2-3間質(zhì)細(xì)胞β-半乳糖苷酶細(xì)胞陽(yáng)性率比較

P0.0010a代表和正常組相比，P<0.05圖2-3間質(zhì)細(xì)胞β-半乳糖苷酶細(xì)胞陽(yáng)性率比較

圖2-4間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期分布

模型組睪丸間質(zhì)細(xì)胞G1期比例增加，S期所占比重明顯減少，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05；見(jiàn)圖2-4，5，6；表2-10）。圖2-4間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期分布表2-10細(xì)胞周期分布百分比%（x±s）組別百分比%G1G2S正常組88.9633±0.621....

本文編號(hào)：3917096