缺血性疾病如:腦缺血、肢體缺血、心肌缺血等已成為威脅人類健康的殺手之一。目前,促進(jìn)缺血后血管新生,改善側(cè)支循環(huán)來治療缺血性疾病已成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在血管生成至成熟過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells,ECs）起到極其關(guān)鍵的作用。已有相關(guān)研究表明m TOR-Rictor在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用,但其在血管形成至成熟過程中的作用機(jī)制還不明確。本課題前期研究表明Rictor缺失后,小鼠術(shù)后缺血區(qū)新生血管數(shù)量雖有增加但相對正常血管內(nèi)皮細(xì)胞排列絮亂且形態(tài)不規(guī)則。為了驗(yàn)證Rictor在血管成熟中是否發(fā)揮作用及探索其作用機(jī)制,本課題通過利用m TOR阻斷劑KU0063794及m TORC1阻斷劑Rapamycin,缺氧環(huán)境下,細(xì)胞水平間接推測m TOR-Rictor在缺血后血管成熟中的作用機(jī)制,并通過整體動(dòng)物水平及細(xì)胞水平RNA干擾驗(yàn)證m TOR-Rictor在血管成熟中作用。方法:1、原代培養(yǎng)小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（mouse aortic endothelial cells,MAECs）,用免疫熒光方法鑒定MAECs。采用體外i CELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系... 

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中英文名稱對照與縮略詞表
引言
實(shí)驗(yàn)研究
    第一部分 細(xì)胞水平，KU0063794、Rapamycin間接檢測Rictor在血管生成過程中的作用機(jī)制研究
        1.實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 實(shí)驗(yàn)藥物
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
            1.5 藥物及試劑配制
        2.實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 MAECs原代培養(yǎng)
            2.2 細(xì)胞復(fù)蘇與凍存
            2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)
            2.4 免疫熒光法鑒定MAECs
            2.5 CCK8法測定藥物對MAECs生存影響
            2.6 iCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測藥物對MAECs增殖的影響
            2.7 mTOR-Rictor對細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響
                2.7.1 侵襲實(shí)驗(yàn)
                2.7.2 劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.8 MAECs成環(huán)實(shí)驗(yàn)
            2.9 缺氧情況下酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測VEGF、ANG1的釋放量
            2.10 Rictor對血管新生及成熟過程中相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響
                2.10.1 用于蛋白印跡溶液的配制
                2.10.2 MAECs和內(nèi)皮組織總蛋白的提取和定量
                2.10.3 凝膠配置、電泳
                2.10.4 轉(zhuǎn)膜
                2.10.5 抗體結(jié)合
                2.10.6 ECL化學(xué)發(fā)光檢測
        3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4.結(jié)果
            4.1 MAECs的形態(tài)觀察
            4.2 免疫熒光鑒定MAECs
            4.3 KU0063794及Rapamycin對MAECs存活的影響
            4.4 Rictor對MAECs遷移、侵襲能力的影響
            4.5 Rictor對MAECs成環(huán)能力的影響
            4.6 酶聯(lián)反應(yīng)法測量VEGF、ANG1結(jié)果
            4.7 Rictor的表達(dá)變化對血管形成成熟的相關(guān)蛋白影響
        5.討論
        6.結(jié)論
    第二部分 細(xì)胞水平及動(dòng)物水平，RNA干擾驗(yàn)證Rictor對血管生成的調(diào)節(jié)作用
        1.實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
        2.實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞水平干擾Rictor表達(dá)
                2.1.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MAECs
                2.1.2 細(xì)胞蛋白提取
                2.1.3 western blotting實(shí)驗(yàn)
                2.1.4 總RNA提取（Trizol法）
                2.1.5 逆轉(zhuǎn)錄
                2.1.6 QPCR檢測
                2.1.7 酶聯(lián)免疫法測ANG1含量
            2.2 動(dòng)物水平驗(yàn)證Rictor在血管生成中作用
                2.2.1 小鼠下肢缺血模型建造
                2.2.2 體內(nèi)Rictor干擾實(shí)驗(yàn)
                    2.2.2.1 組織蛋白提取
                2.2.3 免疫熒光法檢測Rictor下調(diào)術(shù)后7天，血管新生情況
        3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.1 western blot檢測Rictor下調(diào)后血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)變化
            4.2 QPCR結(jié)果
            4.3 Rictor下調(diào)后MAECs中ANG1含量測定結(jié)果
            4.4 小鼠下肢缺血造模血管位置
            4.5 體內(nèi)干擾Rictor結(jié)果
            4.6 免疫熒光法檢測Rictor下調(diào)術(shù)后小鼠血管新生情況
        5.討論
        6.結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]白藜蘆醇在治療動(dòng)脈粥樣硬化中關(guān)鍵信號通路mTOR和STAT3轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 呼延婕,張戈,孫林.  昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2013(01)
[3]泰山白花丹參提取物對人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、黏附及分泌NO的影響[J]. 焦鵬,常起,陳彬,楊娜娜,唐瑜菁,夏作理.  中華中醫(yī)藥雜志. 2011(11)
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[10]槲皮素對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 林蓉,劉俊田,李旭,陳葳.  中國循環(huán)雜志. 2000(05)

碩士論文
[1]Rictor/mTORC2在小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控研究[D]. 鄭蓓.浙江大學(xué) 2014



本文編號：3698444