8-O-乙酰山梔子苷甲酸對(duì)慢性炎性痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制研究
發(fā)布時(shí)間：2021-03-02 03:51
目的:研究8-O-乙酰山梔子苷甲酸（8-OaS）對(duì)慢性炎性痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。方法:將30只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和8-OaS低、中、高劑量組（3、10、30μg/kg）,每組6只。除假手術(shù)組外,其余各組大鼠足底注射弗氏完全佐劑復(fù)制慢性炎性痛模型。造模成功后,各組大鼠鞘內(nèi)給予相應(yīng)藥物,每天1次,連續(xù)給藥7 d后,采用Von-Frey細(xì)絲檢測(cè)各組大鼠足底疼痛閾值,計(jì)算各組大鼠疼痛閾值曲線下面積和8-OaS的半數(shù)有效劑量（ED50）。另取36只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和8-OaS組（給藥劑量為ED50）,同法造模及給藥,然后采用免疫熒光組織染色法觀察各組大鼠脊髓背角內(nèi)離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba-1）、磷酸化p38絲裂原激活的蛋白激酶（p-p38 MAPK）的陽(yáng)性表達(dá)情況,采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1、p-p38 MAPK、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:與假手術(shù)組比較,模型組大鼠足底疼痛閾值和曲線下面積均顯著降低（P&...
【文章來(lái)源】：中國(guó)藥房. 2020,31(13)北大核心
【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)
【部分圖文】：
各組大鼠足底疼痛閾值曲線下面積測(cè)定結(jié)果
采用免疫熒光組織染色法檢測(cè)。第二批大鼠末次給藥后，各組取6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速開(kāi)胸，沿心尖位置扎入灌注針，打開(kāi)灌注閥門(mén)用0.01 mol/L的PBS迅速?zèng)_出大鼠體內(nèi)血液，待其肝臟發(fā)白時(shí)加入4%多聚甲醛固定。取出固定好的大鼠脊髓L4～L6節(jié)段，繼續(xù)固定2 h后取出，置于30%蔗糖溶液中脫水48 h，在冷凍切片機(jī)中切成25μm薄片，再用PBS漂洗10 min×3次，以5%山羊血清封閉2 h；加入單克隆小鼠抗Iba-1抗體和單克隆兔抗p-p38 MAPK抗體，于4℃孵育48 h；用PBS漂洗10 min×3次，滴加Alexa Flour?594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG和Alexa Flour?488標(biāo)記的驢抗兔IgG，置于室溫孵育4 h；用PBS漂洗10min×3次，在暗光條件下將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上，并置于暗盒中，待表面水分自然晾干后使用熒光封片劑封片。采用多通道共聚焦顯微鏡觀察切片中表達(dá)Iba-1、p-p38MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞，以出現(xiàn)紅色和綠色顆粒為其陽(yáng)性表達(dá)，黃色為兩者雙重標(biāo)記的陽(yáng)性表達(dá)；采用Image Pro Plus 6.0軟件分析黃色區(qū)域的熒光密度，熒光密度越大則蛋白表達(dá)越強(qiáng)。各組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1和p-p38MAPK蛋白表達(dá)的免疫熒光組織染色圖見(jiàn)圖2，熒光密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由圖2和表2可知，p-p38 MAPK表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞主要與Iba-1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞（即小膠質(zhì)細(xì)胞）重合。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1和p-p38MAPK蛋白表達(dá)的熒光密度顯著升高（P<0.01），表明小膠質(zhì)細(xì)胞被激活；與模型組比較，8-OaS組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的熒光密度顯著降低（P<0.05），表明8-OaS可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。
采用Western blotting法檢測(cè)。第二批大鼠末次給藥后，各組取剩余6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速開(kāi)胸，沿心尖位置扎入灌注針，打開(kāi)灌注閥門(mén)用0.01 mol/L的PBS迅速?zèng)_出大鼠體內(nèi)血液。待其肝臟發(fā)白時(shí)，于冰上迅速取出脊髓L4～L6節(jié)段，迅速分離脊髓背角，置于事先溶解有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的強(qiáng)效裂解液中，靜置10 min后采用超聲組織裂解儀將組織裂解，以3 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。取蛋白進(jìn)行變性處理，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白條帶，以PVDF轉(zhuǎn)膜后采用5%脫脂奶粉封閉10 min，再依次加入小鼠抗Iba-1單克隆抗體、兔抗p38 MAPK單克隆抗體、兔抗p-p38 MAPK單克隆抗體、小鼠抗IL-6多克隆抗體、小鼠抗IL-β多克隆抗體、兔抗TNF-α多克隆抗體及小鼠抗β-actin抗體（稀釋比例為1∶500），封袋后搖床振蕩4 h；用TBST漂洗10 min×3次，對(duì)應(yīng)加入HRP標(biāo)記的驢抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG（稀釋比例為1∶1 000），室溫振蕩1 h；用TBST漂洗10 min×3次，加入ECL液進(jìn)行反應(yīng)。采用全能型成像系統(tǒng)掃描條帶，以β-actin或p38 MAPK為內(nèi)參，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析各條帶相對(duì)灰度值，用來(lái)表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。各組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β及TNF-α蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖3，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由圖3和表3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，8-OaS組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。
本文編號(hào)：3058547
【文章來(lái)源】：中國(guó)藥房. 2020,31(13)北大核心
【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)
【部分圖文】：
各組大鼠足底疼痛閾值曲線下面積測(cè)定結(jié)果
采用免疫熒光組織染色法檢測(cè)。第二批大鼠末次給藥后，各組取6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速開(kāi)胸，沿心尖位置扎入灌注針，打開(kāi)灌注閥門(mén)用0.01 mol/L的PBS迅速?zèng)_出大鼠體內(nèi)血液，待其肝臟發(fā)白時(shí)加入4%多聚甲醛固定。取出固定好的大鼠脊髓L4～L6節(jié)段，繼續(xù)固定2 h后取出，置于30%蔗糖溶液中脫水48 h，在冷凍切片機(jī)中切成25μm薄片，再用PBS漂洗10 min×3次，以5%山羊血清封閉2 h；加入單克隆小鼠抗Iba-1抗體和單克隆兔抗p-p38 MAPK抗體，于4℃孵育48 h；用PBS漂洗10 min×3次，滴加Alexa Flour?594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG和Alexa Flour?488標(biāo)記的驢抗兔IgG，置于室溫孵育4 h；用PBS漂洗10min×3次，在暗光條件下將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上，并置于暗盒中，待表面水分自然晾干后使用熒光封片劑封片。采用多通道共聚焦顯微鏡觀察切片中表達(dá)Iba-1、p-p38MAPK的陽(yáng)性細(xì)胞，以出現(xiàn)紅色和綠色顆粒為其陽(yáng)性表達(dá)，黃色為兩者雙重標(biāo)記的陽(yáng)性表達(dá)；采用Image Pro Plus 6.0軟件分析黃色區(qū)域的熒光密度，熒光密度越大則蛋白表達(dá)越強(qiáng)。各組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1和p-p38MAPK蛋白表達(dá)的免疫熒光組織染色圖見(jiàn)圖2，熒光密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由圖2和表2可知，p-p38 MAPK表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞主要與Iba-1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞（即小膠質(zhì)細(xì)胞）重合。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1和p-p38MAPK蛋白表達(dá)的熒光密度顯著升高（P<0.01），表明小膠質(zhì)細(xì)胞被激活；與模型組比較，8-OaS組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的熒光密度顯著降低（P<0.05），表明8-OaS可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。
采用Western blotting法檢測(cè)。第二批大鼠末次給藥后，各組取剩余6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速開(kāi)胸，沿心尖位置扎入灌注針，打開(kāi)灌注閥門(mén)用0.01 mol/L的PBS迅速?zèng)_出大鼠體內(nèi)血液。待其肝臟發(fā)白時(shí)，于冰上迅速取出脊髓L4～L6節(jié)段，迅速分離脊髓背角，置于事先溶解有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的強(qiáng)效裂解液中，靜置10 min后采用超聲組織裂解儀將組織裂解，以3 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。取蛋白進(jìn)行變性處理，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白條帶，以PVDF轉(zhuǎn)膜后采用5%脫脂奶粉封閉10 min，再依次加入小鼠抗Iba-1單克隆抗體、兔抗p38 MAPK單克隆抗體、兔抗p-p38 MAPK單克隆抗體、小鼠抗IL-6多克隆抗體、小鼠抗IL-β多克隆抗體、兔抗TNF-α多克隆抗體及小鼠抗β-actin抗體（稀釋比例為1∶500），封袋后搖床振蕩4 h；用TBST漂洗10 min×3次，對(duì)應(yīng)加入HRP標(biāo)記的驢抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG（稀釋比例為1∶1 000），室溫振蕩1 h；用TBST漂洗10 min×3次，加入ECL液進(jìn)行反應(yīng)。采用全能型成像系統(tǒng)掃描條帶，以β-actin或p38 MAPK為內(nèi)參，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析各條帶相對(duì)灰度值，用來(lái)表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。各組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β及TNF-α蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖3，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由圖3和表3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，8-OaS組大鼠脊髓背角內(nèi)Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。
本文編號(hào)：3058547
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