靈菌紅素(Prodigiosin)是一類天然紅色色素的總稱,具有抗菌、抗瘧原蟲、免疫抑制和抗腫瘤等生物活性。美國國立癌癥研究所(NSI)報道,靈菌紅素對57種人源性腫瘤細胞具有抗性,但對正常細胞不具明顯的毒性,說明靈菌紅素具有成為抗腫瘤藥物的潛力。粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)是靈菌紅素主要產(chǎn)生菌,假單胞菌和放線菌等微生物也具有產(chǎn)生靈菌紅素能力。我們課題組從中藥蜚蠊腸道中分離得到4株粘質(zhì)沙雷氏菌,其中菌株WA12-1-18具有穩(wěn)定產(chǎn)生紅色色素的能力,經(jīng)鑒定該紅色色素為靈菌紅素。在此基礎(chǔ)上,采用體外細胞實驗和體內(nèi)荷瘤裸鼠動物實驗初步研究靈菌紅素的抗腫瘤活性。1、研究目的評價蜚蠊腸道粘質(zhì)沙雷氏菌次生代謝物靈菌紅素的抗腫瘤活性,并初步探討其抗腫瘤作用機制,為靈菌紅素開發(fā)成新一代抗腫瘤藥物奠定理論條件。2、研究方法(1)蜚蠊腸道內(nèi)生粘質(zhì)沙雷氏菌WA12-1-18的形態(tài)和分子鑒定光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌株WA12-1-18的形態(tài)特征,16S rDNA、BLAST同源性比對、MEGA軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹等方法對菌株進行分子生物學分類與鑒定。(2)靈菌紅素制備與鑒定采用固體發(fā)酵法對粘質(zhì)沙雷氏菌WA12-1-18進行發(fā)酵,經(jīng)硅膠柱層析等技術(shù)分離純化得到紅色色素單體后,采用高效液相(HPLC)、紫外(UV)、紅外(IR)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和核磁共振(NMR)等技術(shù)鑒定該化合物結(jié)構(gòu)。(3)靈菌紅素體外抗腫瘤作用以宮頸癌細胞Hela、鼻咽癌細胞CNE-2、耐紫杉醇肺癌細胞A549T、耐阿霉素乳腺癌細胞MCF-7/ADR為實驗對象,通過MTT法、流式細胞術(shù)、熒光染色、電子顯微鏡、Westernblot和qRT-PCR法等技術(shù)檢測靈菌紅素的體外抗腫瘤活性。(4)靈菌紅素體內(nèi)抗腫瘤作用通過體內(nèi)Hela荷瘤裸鼠實驗,初步評價靈菌紅素體內(nèi)抗腫瘤作用及其對心、肝、脾、腎等主要生命臟器的影響。3、研究結(jié)果(1)蜚蠊腸道內(nèi)生粘質(zhì)沙雷氏菌WA12-1-18的分離與鑒定從蜚蠊腸道分離得到的紅色菌株WA12-1-18經(jīng)形態(tài)學鑒定為革蘭氏陰性紅色短桿菌,經(jīng)分子生物學鑒定,與來源于土壤的粘質(zhì)沙雷氏菌相似度為99.58%,初步鑒定WA12-1-18是粘質(zhì)沙雷氏菌。(2)靈菌紅素制備與鑒定分離純化后得到紅色粉末,產(chǎn)量達到2.77 g/L。經(jīng)高效液相、紫外、紅外、液質(zhì)聯(lián)用以及核磁共振鑒定該產(chǎn)物為靈菌紅素。穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明:靈菌紅素宜在酸性、暗處、溫度不超過60℃的條件下儲存,另外靈菌紅素對個別金屬離子容易發(fā)生螯合作用。(3)靈菌紅素體外抗腫瘤作用靈菌紅素對宮頸癌Hela、鼻咽癌CNE-2、耐紫杉醇肺癌A549T、耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR的生長具有抑制作用,并可改變各腫瘤細胞生長周期的分布和誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡,作用效果與作用時間和藥物濃度呈依賴關(guān)系。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果表明,靈菌紅素能使Hela、CNE-2細胞膜表面坍塌皺縮以及尾足消失,細胞內(nèi)部產(chǎn)生空泡結(jié)構(gòu),核邊集化,并產(chǎn)生部分凋亡小體。Westernblot以及qRT-PCR結(jié)果表明,靈菌紅素可以抑制Hela細胞抑凋亡基因Bcl-2以及促進促凋亡基因Bax的活化,引起caspase-3的活化,最終導致腫瘤凋亡。(4)靈菌紅素體內(nèi)抗腫瘤作用靈菌紅素可以有效地抑制宮頸癌荷瘤裸鼠的瘤體生長,抑制率達到20.6%。瘤體病理組織HE結(jié)果顯示,靈菌紅素治療組腫瘤細胞稀疏,核小且染色淺,部分核固縮。免疫組化結(jié)果表明,靈菌紅素可抑制抑凋亡基因Bcl-2和促進促凋亡基因Bax的表達。另外,靈菌紅素對裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃等主要生命臟器均無不良影響。4、研究結(jié)論蜚蠊腸道內(nèi)生粘質(zhì)沙雷氏菌WA12-1-18具有穩(wěn)定產(chǎn)生靈菌紅素的生物特性,體外細胞和荷瘤裸鼠動物實驗均發(fā)現(xiàn)靈菌紅素具有抗腫瘤活性。為靈菌紅素的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
【學位單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

廣東藥科大學碩士研究生畢業(yè)論文 粘質(zhì)沙雷氏菌 WA12-1-18 形態(tài)學鑒定菌株 WA12-1-18 在 LB 固體培養(yǎng)基上 28 ℃培養(yǎng) 3 天后，光學顯微鏡表面光滑，呈球狀凸起，具粘稠，顏色為鮮紅色（圖 2-1A）；經(jīng)革發(fā)現(xiàn)菌體被染成紅色（圖 2-1B），提示菌株 WA12-1-18 為革蘭氏陰電鏡結(jié)果顯示，菌株 WA12-1-18 菌體呈短桿狀，兩端稍圓，無芽孢（圖

圖 2-2 菌株 WA12-1-18 的 PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測以及 16S rDNA 序列②菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹分析將菌株 WA12-1-18 的測序結(jié)果同 GenBan 數(shù)據(jù)庫中的相似菌株進行 16rDNA 比對，結(jié)果見圖 2-3，采用 DNAman6.0 進一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株 WA12-1-與粘質(zhì)沙雷氏菌相識度高達 99.58%。通過 Mega5.1 軟件，采用最大似值法構(gòu)建菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2-4），結(jié)果表明菌株 WA12-1-18 為粘質(zhì)沙雷菌屬。

圖 2-2 菌株 WA12-1-18 的 PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測以及 16S rDNA 序列②菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹分析將菌株 WA12-1-18 的測序結(jié)果同 GenBan 數(shù)據(jù)庫中的相似菌株進行 16SrDNA 比對，結(jié)果見圖 2-3，采用 DNAman6.0 進一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株 WA12-1-18與粘質(zhì)沙雷氏菌相識度高達 99.58%。通過 Mega5.1 軟件，采用最大似值法構(gòu)建菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2-4），結(jié)果表明菌株 WA12-1-18 為粘質(zhì)沙雷氏菌屬。
【參考文獻】

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本文編號：2893806