脂肪組織通過前脂肪細胞的增殖,分化和凋亡的組合形成。肥胖及其相關疾病就是由于脂肪組織過度增長而引發(fā),因此對脂肪細胞的分化調控和成熟脂肪細胞的降解調控則是研究肥胖及其相關疾病的關鍵點。脂滴(LD)在細胞中充當亞細胞結構并存在于所有生物的體細胞中。長期以來,在脂肪細胞中,脂肪滴僅被認為是脂質的儲存結構,并且是為身體提供能量的儲存池。并為生物大分子的合成提供脂質原料,如新生細胞膜和脂蛋白等,但是近十年來的研究表明,脂肪滴作用的多樣化遠超乎了人們的想象。在脂肪代謝的調節(jié)中,脂肪滴不是被動的儲存場所,而是高度活躍且重要的細胞器�？茖W家通過研究脂肪滴相關疾病揭示了脂肪滴的多樣性。脂肪滴異常會導致的相關疾病有:肥胖、衣原體感染、糖尿病、動脈粥樣硬化癥及肝臟疾病等多種疾病,而這些疾病的始動環(huán)節(jié)就是脂代謝的紊亂。蟲草素(3'-脫氧腺苷)最初從蛹蟲草中分離,作為減肥和降脂的天然化合物。具有良好的發(fā)展前景,其優(yōu)點是多目標,多渠道,無毒副作用。它具有多種生物和藥理活性,包括降血糖,抗糖尿病,抗癌,免疫刺激,抗病毒和抗感染。由于其藥理學和治療意義廣泛,受到越來越多的關注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),蟲草素在減肥的同時也顯著地降低了脂肪細胞里面的脂肪滴含量,故蟲草素能否通過抑制脂肪細胞脂肪滴形成、生長和誘導脂肪滴的降解來調節(jié)脂肪細胞脂類代謝是一個值得探究的科學問題。本研究首先通過構建大鼠肥胖模型評價蟲草素的減肥效果和對不同脂肪組織(白色脂肪、黃色脂肪和褐色脂肪)及血脂、脂肪細胞內脂肪滴的影響;然后以3T3-L1脂肪前體細胞作為脂肪代謝的模型細胞,考察蟲草素是否能夠抑制脂肪細胞脂肪滴形成、生長和誘導脂肪滴的降解;最后針對體外3T3-L1細胞,利用分子生物學手段對蟲草素影響脂肪滴的含量調節(jié)脂肪細胞脂類代謝的可能機制進行初步研究。首先,我們通過給予SD大鼠高脂飼料,構建了脂肪細胞脂類代謝紊亂的代表性疾病肥胖的動物模型。給SD大鼠低,中,高劑量(12.5,25,50 mg/kg)的蟲草素,連續(xù)灌胃8周后,測定體重,脂肪系數(shù)和相關的生化指標。并觀察肝組織和脂肪組織的病理變化。提取大鼠脂肪細胞,用ASC-1、PAT2和P2RX5分別標記白色脂肪、黃色脂肪和褐色脂肪,并用BODIPY染色檢測脂肪滴含量的變化。實驗結果表明,給予高劑量(50 mg/kg)蟲草素的大鼠可以顯著降低體重和脂肪系數(shù)(P0.01),中劑量(25 mg/kg)蟲草素大鼠體重和脂肪系數(shù)顯著降低(P0.05),低劑量的蟲草素組(12.5 mg/kg)不會降低大鼠的體重和脂肪系數(shù);蟲草素顯著降低血清甘油三酯(TG),膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL),天冬氨酸氨基轉移酶(AST),丙氨酸氨基轉移酶(ALT),丙二醛(MDA)和外周蛋白(Perilipin1、Perilipin2、Perilipin3)含量(P0.01),并顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P0.01);高劑量的蟲草素(50 mg/kg)極顯著增加高密度脂蛋白(HDL)(P0.01),中劑量組(25 mg/kg)顯著增加HDL(P0.05)。肝臟病理切片顯示低,中,高劑量(12.5,25,50 mg/kg)蟲草素均能對高脂飲食誘導造成的肝臟損傷起到一定的保護作用;脂肪病理切片的HE染色結果顯示,低,中,高劑量(12.5,25,50 mg/kg)的蟲草素可顯著抑制脂肪細胞的增加;蟲草素還能以劑量依賴性方式顯著降低白色脂肪細胞的含量(P0.05),它顯著促進了黃色脂肪細胞的燃燒(P0.01),顯著增加了棕色脂肪細胞的含量(P0.01),這表明蟲草素可以加速脂肪細胞的轉化,從而促進脂肪的消耗;另外,對來自體內脂肪細胞內的脂肪滴檢測結果顯示,低、中、高劑量(12.5,25,50 mg/kg)蟲草素以劑量依賴性方式減少脂肪細胞中的脂肪滴。其次,我們在體外培養(yǎng)3T3-L1細胞,誘導劑1(含有IBMX,胰島素,地塞米松,青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)和誘導劑2(含有胰島素,青鏈霉素和10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)誘導3T3-L1細胞分化為成熟脂肪細胞,分別在加誘導劑的不同時間段加蟲草素以檢測蟲草素對脂肪滴形成、生長和降解三個不同階段的影響,蟲草素均給予不同濃度(1.563、3.125、6.25、12.5、25μg/mL),作用時長為168小時,用BODIPY染色,通過熒光顯微鏡檢測,并且通過Image J軟件定量脂肪滴的含量。實驗結果顯示,蟲草素以濃度依賴的方式顯著抑制脂滴的形成和生長,并且誘導成熟脂肪細胞中的脂滴降解,促進脂肪細胞的去分化。最后,針對誘導劑1(含IBMX、胰島素、地塞米松、青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)和誘導劑2(含有胰島素,青霉素和10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)誘導3T3-L1細胞分化為成熟脂肪細胞,利用western blot技術檢測與脂肪滴形成相關基因Perilipin2、Perilipin3、Fsp27和PPAR-γ的表達情況;通過蛋白質印跡檢測與脂肪滴生長相關的Rab5,Rab11和Fsp27的表達。通過蛋白質印跡檢測與脂肪滴降解相關的ATGL,CGI-58和Perilipin1的表達。結果顯示:蟲草素通過下調Fsp27、Perilipin2和Perilipin3的表達來顯著抑制脂滴的形成,而PPAR-γ沒有參與這一過程。經6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL蟲草素處理,Rab5的蛋白質表達略微降低;經6.25μg/mL和25μg/mL蟲草素處理,Rab11表達水平顯著降低;經25μg/mL蟲草素處理,Fsp27的蛋白質表達顯著降低;這表明蟲草素通過調節(jié)Rab5,Rab11和Fsp27抑制分化的3T3-L1細胞中脂肪滴的生長。蟲草素處理導致Perilipin1和CGI-58表達水平顯著降低,相反,ATGL表達顯著增加,這表明蟲草素可通過增加ATGL表達和減少Perilipin1表達而不是通過影響CGI-58表達來發(fā)揮降解脂肪作用。這些結果表明,蟲草素抑制脂肪滴的形成、生長相關基因的表達,并抑制和誘導與脂肪滴降解相關的基因的表達。從而影響脂肪滴的含量,實現(xiàn)脂肪細胞脂質代謝的調節(jié)�？傊�,本研究結果表明,蟲草素對肥胖模型大鼠具有減肥的作用;蟲草素體外調節(jié)脂肪細胞脂類代謝的機制是通過影響脂肪滴的含量實現(xiàn)的,包括下調Fsp27、Perilipin2和Perilipin3的表達來較少脂滴的形成;下調Rab5、Rab11和Fsp27的表達抑制的脂肪滴分化;增加ATGL表達和降低Perilipin1表達來降解脂肪滴。這些結果為蟲草素作為新型減肥藥物進一步開發(fā)提供了實驗基礎和理論基礎。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

脂肪滴的基本形態(tài)

圖 3.2 通過內質網(wǎng)內的應力形成 LD 的模型2 Models of LD formation through stress within the endoplasmic re肪滴的生長過程

脂肪滴生長機制Fig3.3MechanismsofLDgrowthinclude
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本文編號：2893781