脂肪組織通過前脂肪細(xì)胞的增殖,分化和凋亡的組合形成。肥胖及其相關(guān)疾病就是由于脂肪組織過度增長而引發(fā),因此對脂肪細(xì)胞的分化調(diào)控和成熟脂肪細(xì)胞的降解調(diào)控則是研究肥胖及其相關(guān)疾病的關(guān)鍵點(diǎn)。脂滴(LD)在細(xì)胞中充當(dāng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并存在于所有生物的體細(xì)胞中。長期以來,在脂肪細(xì)胞中,脂肪滴僅被認(rèn)為是脂質(zhì)的儲存結(jié)構(gòu),并且是為身體提供能量的儲存池。并為生物大分子的合成提供脂質(zhì)原料,如新生細(xì)胞膜和脂蛋白等,但是近十年來的研究表明,脂肪滴作用的多樣化遠(yuǎn)超乎了人們的想象。在脂肪代謝的調(diào)節(jié)中,脂肪滴不是被動的儲存場所,而是高度活躍且重要的細(xì)胞器�？茖W(xué)家通過研究脂肪滴相關(guān)疾病揭示了脂肪滴的多樣性。脂肪滴異常會導(dǎo)致的相關(guān)疾病有:肥胖、衣原體感染、糖尿病、動脈粥樣硬化癥及肝臟疾病等多種疾病,而這些疾病的始動環(huán)節(jié)就是脂代謝的紊亂。蟲草素(3'-脫氧腺苷)最初從蛹蟲草中分離,作為減肥和降脂的天然化合物。具有良好的發(fā)展前景,其優(yōu)點(diǎn)是多目標(biāo),多渠道,無毒副作用。它具有多種生物和藥理活性,包括降血糖,抗糖尿病,抗癌,免疫刺激,抗病毒和抗感染。由于其藥理學(xué)和治療意義廣泛,受到越來越多的關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),蟲草素在減肥的同時也顯著地降低了脂肪細(xì)胞里面的脂肪滴含量,故蟲草素能否通過抑制脂肪細(xì)胞脂肪滴形成、生長和誘導(dǎo)脂肪滴的降解來調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂類代謝是一個值得探究的科學(xué)問題。本研究首先通過構(gòu)建大鼠肥胖模型評價蟲草素的減肥效果和對不同脂肪組織(白色脂肪、黃色脂肪和褐色脂肪)及血脂、脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪滴的影響;然后以3T3-L1脂肪前體細(xì)胞作為脂肪代謝的模型細(xì)胞,考察蟲草素是否能夠抑制脂肪細(xì)胞脂肪滴形成、生長和誘導(dǎo)脂肪滴的降解;最后針對體外3T3-L1細(xì)胞,利用分子生物學(xué)手段對蟲草素影響脂肪滴的含量調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂類代謝的可能機(jī)制進(jìn)行初步研究。首先,我們通過給予SD大鼠高脂飼料,構(gòu)建了脂肪細(xì)胞脂類代謝紊亂的代表性疾病肥胖的動物模型。給SD大鼠低,中,高劑量(12.5,25,50 mg/kg)的蟲草素,連續(xù)灌胃8周后,測定體重,脂肪系數(shù)和相關(guān)的生化指標(biāo)。并觀察肝組織和脂肪組織的病理變化。提取大鼠脂肪細(xì)胞,用ASC-1、PAT2和P2RX5分別標(biāo)記白色脂肪、黃色脂肪和褐色脂肪,并用BODIPY染色檢測脂肪滴含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給予高劑量(50 mg/kg)蟲草素的大鼠可以顯著降低體重和脂肪系數(shù)(P0.01),中劑量(25 mg/kg)蟲草素大鼠體重和脂肪系數(shù)顯著降低(P0.05),低劑量的蟲草素組(12.5 mg/kg)不會降低大鼠的體重和脂肪系數(shù);蟲草素顯著降低血清甘油三酯(TG),膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL),天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),丙二醛(MDA)和外周蛋白(Perilipin1、Perilipin2、Perilipin3)含量(P0.01),并顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P0.01);高劑量的蟲草素(50 mg/kg)極顯著增加高密度脂蛋白(HDL)(P0.01),中劑量組(25 mg/kg)顯著增加HDL(P0.05)。肝臟病理切片顯示低,中,高劑量(12.5,25,50 mg/kg)蟲草素均能對高脂飲食誘導(dǎo)造成的肝臟損傷起到一定的保護(hù)作用;脂肪病理切片的HE染色結(jié)果顯示,低,中,高劑量(12.5,25,50 mg/kg)的蟲草素可顯著抑制脂肪細(xì)胞的增加;蟲草素還能以劑量依賴性方式顯著降低白色脂肪細(xì)胞的含量(P0.05),它顯著促進(jìn)了黃色脂肪細(xì)胞的燃燒(P0.01),顯著增加了棕色脂肪細(xì)胞的含量(P0.01),這表明蟲草素可以加速脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)脂肪的消耗;另外,對來自體內(nèi)脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴檢測結(jié)果顯示,低、中、高劑量(12.5,25,50 mg/kg)蟲草素以劑量依賴性方式減少脂肪細(xì)胞中的脂肪滴。其次,我們在體外培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞,誘導(dǎo)劑1(含有IBMX,胰島素,地塞米松,青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)和誘導(dǎo)劑2(含有胰島素,青鏈霉素和10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞,分別在加誘導(dǎo)劑的不同時間段加蟲草素以檢測蟲草素對脂肪滴形成、生長和降解三個不同階段的影響,蟲草素均給予不同濃度(1.563、3.125、6.25、12.5、25μg/mL),作用時長為168小時,用BODIPY染色,通過熒光顯微鏡檢測,并且通過Image J軟件定量脂肪滴的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蟲草素以濃度依賴的方式顯著抑制脂滴的形成和生長,并且誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞中的脂滴降解,促進(jìn)脂肪細(xì)胞的去分化。最后,針對誘導(dǎo)劑1(含IBMX、胰島素、地塞米松、青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)和誘導(dǎo)劑2(含有胰島素,青霉素和10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞,利用western blot技術(shù)檢測與脂肪滴形成相關(guān)基因Perilipin2、Perilipin3、Fsp27和PPAR-γ的表達(dá)情況;通過蛋白質(zhì)印跡檢測與脂肪滴生長相關(guān)的Rab5,Rab11和Fsp27的表達(dá)。通過蛋白質(zhì)印跡檢測與脂肪滴降解相關(guān)的ATGL,CGI-58和Perilipin1的表達(dá)。結(jié)果顯示:蟲草素通過下調(diào)Fsp27、Perilipin2和Perilipin3的表達(dá)來顯著抑制脂滴的形成,而PPAR-γ沒有參與這一過程。經(jīng)6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL蟲草素處理,Rab5的蛋白質(zhì)表達(dá)略微降低;經(jīng)6.25μg/mL和25μg/mL蟲草素處理,Rab11表達(dá)水平顯著降低;經(jīng)25μg/mL蟲草素處理,Fsp27的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低;這表明蟲草素通過調(diào)節(jié)Rab5,Rab11和Fsp27抑制分化的3T3-L1細(xì)胞中脂肪滴的生長。蟲草素處理導(dǎo)致Perilipin1和CGI-58表達(dá)水平顯著降低,相反,ATGL表達(dá)顯著增加,這表明蟲草素可通過增加ATGL表達(dá)和減少Perilipin1表達(dá)而不是通過影響CGI-58表達(dá)來發(fā)揮降解脂肪作用。這些結(jié)果表明,蟲草素抑制脂肪滴的形成、生長相關(guān)基因的表達(dá),并抑制和誘導(dǎo)與脂肪滴降解相關(guān)的基因的表達(dá)。從而影響脂肪滴的含量,實(shí)現(xiàn)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)�？傊�,本研究結(jié)果表明,蟲草素對肥胖模型大鼠具有減肥的作用;蟲草素體外調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂類代謝的機(jī)制是通過影響脂肪滴的含量實(shí)現(xiàn)的,包括下調(diào)Fsp27、Perilipin2和Perilipin3的表達(dá)來較少脂滴的形成;下調(diào)Rab5、Rab11和Fsp27的表達(dá)抑制的脂肪滴分化;增加ATGL表達(dá)和降低Perilipin1表達(dá)來降解脂肪滴。這些結(jié)果為蟲草素作為新型減肥藥物進(jìn)一步開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

脂肪滴的基本形態(tài)

圖 3.2 通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的應(yīng)力形成 LD 的模型2 Models of LD formation through stress within the endoplasmic re肪滴的生長過程

脂肪滴生長機(jī)制Fig3.3MechanismsofLDgrowthinclude
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本文編號：2893781