選題依據(jù):抑郁癥是一種慢性復(fù)發(fā)性情緒障礙,是全球常見(jiàn)的疾病之一。目前,治療抑郁癥以西藥為主,但臨床用藥中常出現(xiàn)毒副作用大及耐受性差等問(wèn)題,從作用溫和、毒副作用小的中藥中研發(fā)理想的抗抑郁藥物成為研究熱點(diǎn)。本課題組在前期研究中已明確源自逍遙散君藥柴胡中的多炔類成分具有抗抑郁活性,且大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明含量較高的柴胡多炔RB-2和RB-4在體內(nèi)呈現(xiàn)出吸收較快消除較慢的特征,在體外單胺遞質(zhì)再攝取抑制活性測(cè)試中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性,有望開(kāi)發(fā)為抗抑郁新藥。因此,探尋柴胡多炔RB-2和RB-4的體內(nèi)外代謝特征、參與代謝過(guò)程的代謝酶的類型及與CYP450代謝酶活性的關(guān)系等體內(nèi)外代謝特征成為必不可少的研究?jī)?nèi)容。通過(guò)研究具有適宜藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的候選化合物體內(nèi)外代謝特征,分析并鑒定其代謝物,闡明代謝途徑,盡可能明確藥物及代謝物的藥理及毒理作用,為研發(fā)降低成本,也為后期臨床安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。目的:明確柴胡多炔RB-2和RB-4體內(nèi)外代謝特征,闡明其代謝途徑,探尋介導(dǎo)柴胡多炔生物轉(zhuǎn)化的CYP450酶,并研究柴胡多炔對(duì)CYP450酶活性的影響,通過(guò)上述研究綜合評(píng)價(jià)柴胡多炔的代謝特征,為后期抗抑郁新藥的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.正常雄性ICR小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組和2個(gè)給藥組,灌胃給予小鼠劑量均為100 mg·kg-1的柴胡多炔RB-2和RB-4,收集小鼠空白生物樣品及血清、尿液、糞便和膽汁,生物樣品的數(shù)據(jù)采集采用RSLC-Q Extractive Orbitrap-MS分析技術(shù),并結(jié)合Compound Discoverier代謝分析軟件對(duì)樣品進(jìn)行分析。通過(guò)分析柴胡多炔原型及代謝物的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律,推測(cè)柴胡多炔在正常小鼠體內(nèi)的代謝途徑。2.將RB-2和RB-4分別加入鼠和混合人肝微粒體溫孵體系中共孵育,運(yùn)用與研究體內(nèi)代謝物相同的方法分析檢測(cè)其生物樣本,推測(cè)柴胡多炔在鼠和混合人肝微粒體共孵育體系中的Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑,并考察柴胡多炔在體內(nèi)外及種屬間代謝特征的差異。3.針對(duì)柴胡多炔在混合人肝微粒體中主要代謝途徑,采用專屬性化學(xué)抑制劑法,在正常的混合人肝微粒體孵育體系中加入FDA推薦的CYP450酶各亞型專屬性化學(xué)抑制劑α-萘黃酮(CYP1A2)、舍曲林(CYP2B6)、孟魯司特(CYP2C8)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、噻氯匹定(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、氯美噻唑(CYP2E1)和酮康唑(CYP3A4),探尋各代謝物的生成抑制率,初步推測(cè)介導(dǎo)柴胡多炔生物轉(zhuǎn)化的CYP450酶;同時(shí)采用人源重組CYP450單純酶法,分析其在人源重組CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4單純酶中在各代謝物生成的貢獻(xiàn)率,進(jìn)一步推測(cè)介導(dǎo)柴胡多炔生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的CYP450酶。結(jié)合兩種方法確定介導(dǎo)柴胡多炔生物轉(zhuǎn)化的CYP450酶的亞型。4.建立基于UHPLC-MS/MS技術(shù)的各亞型CYP450酶探針底物定量分析方法,采用MRM掃描模式,對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,評(píng)價(jià)柴胡多炔對(duì)CYP450酶活性的影響。通過(guò)分析在鼠肝微粒體共孵育體系中探針底物非那西丁(CYP1A2)、依法韋侖(CYP2B6)、紫杉醇(CYP2C8)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、右美沙芬(CYP2D6)、氯唑沙宗(CYP2E1)和睪酮(CYP3A4)反應(yīng)抑制率,初步研究柴胡多炔對(duì)7種CYP450酶活性的影響。結(jié)果:1.通過(guò)與空白對(duì)照組樣品比較,鑒定出在小鼠體內(nèi),柴胡多炔RB-2共產(chǎn)生13種代謝物,主要存在于血清2h和糞便樣品中。根據(jù)推測(cè)出的代謝物結(jié)構(gòu),按其被代謝的程度,可將Ⅰ相代謝中發(fā)生的氧化反應(yīng)的類型分為如下3種;氧化(M1)、脫飽和+氧化(M2)和雙重氧化(M3)、脫飽和+雙重氧化(M4),Ⅱ相代謝通常會(huì)在Ⅰ相代謝反應(yīng)發(fā)生的基礎(chǔ)上發(fā)生結(jié)合反應(yīng),如葡萄糖醛酸結(jié)合(M8)、氧化+葡萄糖醛酸結(jié)合(M5),其他的結(jié)合反應(yīng)類型為氧化+乙�；�(M6)和氧化+GSH結(jié)合(M7);柴胡多炔RB-4的體內(nèi)代謝與RB-2類似,共鑒定出14種代謝物,主要存在于血清2h和糞便樣品中。在Ⅰ相代謝中主要發(fā)生氧化反應(yīng),出現(xiàn)M1、M3、M4這3種類型代謝物,Ⅱ相代謝物M5、M7和M8,另外,RB-4的II相代謝中氧化+硫酸化(M9)為其特有的代謝類型。兩種柴胡多炔及其代謝物均主要隨糞便排出體外。2.通過(guò)與空白孵育基質(zhì)比較,在與鼠肝微粒體共孵育體系中鑒定出柴胡多炔RB-2和RB-4的代謝物分別為5種和3種,其中M1、M4和M5與體內(nèi)代謝物相同。同時(shí),M11(水合+氧化+葡萄糖醛酸結(jié)合)為鼠肝微粒體系中特有。在與混合人肝微粒體共孵育體系中,柴胡多炔RB-2和RB-4的代謝類型與鼠肝微粒體中的有相似之處(M1,M4和M5),但混合人肝微粒體中出現(xiàn)的水合+雙重氧化(M10)類型為其所特有,在鼠微粒體體系和體內(nèi)生物樣品中均未鑒定出。3.采用化學(xué)抑制劑法考察在HLMs中CYP450酶的亞型,結(jié)果表明,參與柴胡多炔RB-2代謝物M4、M1和M10生物轉(zhuǎn)化的酶分別為CYP2C8、CYP2E1和CYP2C9;參與柴胡多炔RB-4代謝物M4、M10-1和M10-2生物轉(zhuǎn)化的酶分別為CYP3A4、CYP2C9和CYP2C9。人源重組CYP450單純酶法研究結(jié)果表明,在柴胡多炔RB-2的代謝轉(zhuǎn)化中,參與代謝物M4生成的CYP450酶貢獻(xiàn)程度大小為CYP2C9CYP2E1CYP2C8,代謝物M1的生成僅有CYP2E1參與,在M10的生成中,CYP450酶的貢獻(xiàn)程度為CYP2C9CYP2C8;在柴胡多炔RB-4的代謝轉(zhuǎn)化中,CYP450酶在代謝物M4的生成中貢獻(xiàn)程度大小為CYP2C8CYP3A4,代謝物M10-1中其貢獻(xiàn)程度為CYP2C9CYP2C8,代謝物M10-2為CYP2C9CYP2B6CYP2C8。結(jié)合兩種方法,介導(dǎo)柴胡多炔生物轉(zhuǎn)化的CYP450酶主要為CYP2C9和CYP2E1,CYP2B6和CYP3A4在其代謝過(guò)程中也發(fā)揮著作用。4.運(yùn)用探針底物法,分析柴胡多炔對(duì)CYP450酶的影響,當(dāng)探針底物反應(yīng)抑制率大于50%時(shí),初步判斷化合物對(duì)CYP450酶具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,柴胡多炔RB-2和RB-4對(duì)CYP1A2的抑制程度分別為38%和24%,對(duì)CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的抑制程度均小于10%。結(jié)論:1.通過(guò)研究柴胡多炔的在小鼠體內(nèi)的代謝特征,明確具有相似結(jié)構(gòu)的柴胡多炔的主要代謝途徑為氧化反應(yīng),葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)等,主要隨糞便排出體外。2.根據(jù)研究探針底物抑制結(jié)果,初步推測(cè)柴胡多炔對(duì)CYP450酶沒(méi)有影響。3.通過(guò)上述研究,說(shuō)明柴胡多炔的體內(nèi)外代謝性質(zhì)較佳,能夠作為抗抑郁藥物研發(fā)過(guò)程中的候選化合物進(jìn)行深入研究。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

柴胡多炔 RB-2 和 RB-4 的代謝研究1.2 研究思路、技術(shù)路線圖、研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)1.2.1 研究思路、技術(shù)路線圖、研究?jī)?nèi)容本課題的研究思路：本課題主要根據(jù)前期已篩選出的柴胡石油醚部位中含量較高的多炔類成分 RB-2 和 RB-4 為研究對(duì)象，首先對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)代謝研究，明確其代謝途徑。隨后，采用體外代謝的研究方法，分析鑒定主要代謝物。進(jìn)一步研究介導(dǎo)生成相關(guān)代謝物的代謝酶。最后，考察柴胡多炔對(duì)代謝酶的活性有影響，根據(jù)上述研究，綜合評(píng)價(jià)柴胡多炔在體內(nèi)外的代謝特征。本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)流程圖如下：

20圖 3.3 RB-2 的一級(jí)質(zhì)譜（A）和二級(jí)質(zhì)譜（B）Figure 3.3 The MS（A） and MS2（B） positive mass spectra of RB-2柴胡多炔 RB-4 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與 RB-2 具有相似性，RB-4 準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z 243.1749（如圖 3.4 (A)所示），一級(jí)掃描時(shí)顯示出的分子離子峰，除準(zhǔn)

22圖 3.4 RB-4 的一級(jí)質(zhì)譜（A）和二級(jí)質(zhì)譜（B）Figure 3.4 The MS（A） and MS2（B） positive mass spectra of RB-43.4.2 柴胡多炔 RB-2 的代謝物結(jié)構(gòu)鑒定將“3.3.5 生物樣品數(shù)據(jù)采集”中所述 Full Scan 掃描模式采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverier 2.0 軟件中進(jìn)行代謝物擬合，通過(guò)與空白樣品比較，尋找可能
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 邢婕;柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)方法及其對(duì)肝臟功能影響研究[D];山西大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2890005