目的:通過體外實(shí)驗(yàn)研究白頭翁醇提物對白血病CEM細(xì)胞生長的影響,進(jìn)一步探討其對白血病CEM細(xì)胞生長的影響機(jī)制。方法:稱取白頭翁飲片150 g,粉碎,70%乙醇浸泡,加熱回流提取,正丁醇萃取,萃取液減壓濃縮,干燥濃縮液,得固體稱重。用三蒸水溶解,備用;采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度白頭翁醇提物作用于CEM細(xì)胞不同時間段的抑制率;光鏡技術(shù)觀察不同濃度白頭翁醇提物作用于CEM細(xì)胞不同時間段的形態(tài)學(xué)改變;DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察白頭翁醇提物作用于CEM細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況;采用Western blot檢測不同濃度白頭翁醇提物作用于白血病CEM細(xì)胞24 h、48 h、72 h后p53、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.白頭翁有效成分(白頭翁皂苷)的提取率將150 g白頭翁飲片粉碎,乙醇浸泡,加熱回流提取,正丁醇萃取,合并萃取液,減壓濃縮、干燥后得白頭翁皂苷粗品8.6 g,提取率5.73%。2.白頭翁醇提物對CEM細(xì)胞生長的抑制率用不同濃度的白頭翁醇提物作用于CEM細(xì)胞同一時間后,隨著白頭翁醇提物濃度(195.3125μg/ml、390.625μg/ml、781.25μg/ml、1562.5μg/ml、3125μg/ml、6250μg/ml、12500μg/ml)的增加OD值逐漸降低,即抑制率逐漸增加;同一濃度,不同時間(24 h、48 h、72 h),隨著作用時間的延長,抑制率逐漸增大。白頭翁醇提物作用白血病CEM細(xì)胞24 h、48 h、72 h的IC_(50)值分別1452μg/ml、774.2μg/ml、589.6μg/ml。3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡下觀察對照組CEM細(xì)胞生長狀況良好,細(xì)胞外形圓潤,大小均勻,細(xì)胞密集,并出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象,飽滿透亮,折光率好;使用不同濃度白頭翁醇提物作用于CEM細(xì)胞可見細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的生長密度偏低,細(xì)胞大小不一、細(xì)胞體積變小,出現(xiàn)細(xì)胞殘渣、碎片,折光率較差等;使用不同濃度白頭翁醇提物作用于CEM細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,油鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化,對照組細(xì)胞呈現(xiàn)大而圓的細(xì)胞核,核漿比例失調(diào),細(xì)胞膜完整;加藥組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞膜皺縮破損,染色質(zhì)凝聚,細(xì)胞核裂解,部分有似凋亡小體的出現(xiàn)。4.DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡條帶白頭翁醇提物(6250μg/ml、3125μg/ml、1562.5μg/ml、781.25μg/ml,390.625μg/ml)作用于CEM細(xì)胞后,提取不同時間段(24 h、48 h、72 h)的DNA,DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,加藥組DNA均在10000 bp以上出現(xiàn)條帶,即在180 bp~200 bp的整數(shù)倍出現(xiàn)條帶,說明細(xì)胞發(fā)生凋亡;對照組DNA僅有一條大分子條帶,說明對照組細(xì)胞未發(fā)生凋亡。5.p53、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示用白頭翁醇提物濃度為390.625μg/ml、781.25μg/ml、1562.5μg/ml、3125μg/ml、6250μg/ml處理CEM細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,以β-actin條帶做參照下,結(jié)果可見:同一時間段,加藥組的p53、Bax蛋白的表達(dá)均比對照組(未加藥)多,且隨著白頭翁醇提物濃度的增加p53、Bax蛋白的表達(dá)增多(P0.05或P0.01);加藥組的Bcl-2蛋白的表達(dá)均比對照組(未加藥)少,且隨著藥物濃度的增加Bcl-2蛋白的表達(dá)減少(P0.05或P0.01);同一藥物濃度,隨著時間的延長,p53、Bax蛋白的表達(dá)逐漸增多(P0.05或P0.01),Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸減少(P0.05或P0.01)。結(jié)論:1.白頭翁醇提物能抑制白血病CEM細(xì)胞的生長。2.白頭翁醇提物對白血病CEM細(xì)胞生長的抑制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。3.白頭翁醇提物誘導(dǎo)白血病CEM細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號通路線粒體途徑中相關(guān)蛋白的表達(dá):(1)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),上調(diào)Bax蛋白的表達(dá),使Bcl-2/Bax的比值下降;(2)上調(diào)p53蛋白的表達(dá),激活下游Bax蛋白表達(dá),抑制Bcl-2蛋白表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

胞膜皺縮破損，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核裂解，部分有似凋亡小體的出現(xiàn)(圖 15-17、圖 19-21、圖 23-25)。圖2 對照組CEM細(xì)胞24 h，細(xì)胞有凸起，折光性好；×100圖3 781.25 μg/ml白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h，部分細(xì)胞有凸起，折光性一般；×100圖 5 12500 μg/ml 白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h，細(xì)胞數(shù)目減少，體積減小，有細(xì)胞殘渣；×100圖6 對照組CEM細(xì)胞48h，細(xì)胞有凸起，折光性好；×100圖 4 3125 μg/ml 白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h

圖2 對照組CEM細(xì)胞24 h，細(xì)胞有凸起，折光性好；×100圖3 781.25 μg/ml白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h，部分細(xì)胞有凸起，折光性一般；×100圖 5 12500 μg/ml 白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h，細(xì)胞數(shù)目減少，體積減小，有細(xì)胞殘渣；×100圖 4 3125 μg/ml 白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h，細(xì)胞數(shù)目減少，體積大小不均，折光性較差；×100

圖 5 12500 μg/ml 白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h，細(xì)胞數(shù)目減少，體積減小，有細(xì)胞殘渣；×100圖6 對照組CEM細(xì)胞48h，細(xì)胞有凸起，折光性好；×100圖 4 3125 μg/ml 白頭翁醇提液作用于 CEM 細(xì)胞 24 h，細(xì)胞數(shù)目減少，體積大小不均，折光性較差；×100圖 7 781.25 μg/ml 白頭翁醇提液作用于CEM細(xì)胞48 h，細(xì)胞有凸起，折光性一般；×100
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