目的:基于觀察體外TGF-β_1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷模型,并結(jié)合鱷嘴花新鮮藥物對(duì)于阿霉素誘導(dǎo)的腎病綜合征(NS)大鼠模型的治療作用及其相應(yīng)的作用機(jī)制,評(píng)價(jià)鱷嘴花鮮藥對(duì)腎纖維化的保護(hù)作用,為鱷嘴花的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:主要分為兩大部分展開研究:(1)鱷嘴花鮮榨汁(CN)對(duì)HK-2細(xì)胞抗增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究a大鼠經(jīng)CN提取物連續(xù)灌胃7天,于末次給藥1 h后,采用腹主動(dòng)脈采血,以制備含藥血清。b取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞進(jìn)行分組,即細(xì)胞對(duì)照組、模型對(duì)照組、CN不同濃度組及含藥血清高、中、低劑量組。除了空白對(duì)照組以外,其余各組均采用TGF-β_1造模,48 h后終止造模,所有組均加入與之相對(duì)應(yīng)的藥物,干預(yù)48 h后終止培養(yǎng),隨后采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活率及生長(zhǎng)狀態(tài)。(2)CN藥液對(duì)腎病綜合征保護(hù)作用的藥效作用及機(jī)制研究將大鼠按體重隨機(jī)分組,即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組、CN高劑量組、CN中劑量組、CN低劑量組,每組10只。除空白對(duì)照組以外,其余各組通過尾靜脈注射阿霉素的方法來(lái)建立大鼠腎病綜合征模型,造模第5周開始給予藥物干預(yù)。分別于給藥第1、2、3、4、5周,分別檢測(cè)大鼠的體重、24 h尿蛋白,并于給藥5周后檢測(cè)血清白蛋白、尿素氮、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、鈉、鉀、氯及腎臟指數(shù)等相關(guān)作用的指標(biāo);之后留取腎臟組織標(biāo)本,用于做光鏡的檢查及免疫組化,并應(yīng)用Western blotting方法觀察腎臟組織中α-SMA、E-cadherin蛋白含量的表達(dá)情況的變化。結(jié)果:(1)CN提取物含藥血清及CN提取物直接給藥均對(duì)HK-2細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。(2)模型對(duì)照組24 h尿白蛋白含量逐漸增加,血清總膽固醇、肌酐、尿素氮、甘油三酯的含量均有所升高,并于第5周達(dá)到高峰;血清白蛋白的含量有所下降,于第5周達(dá)到最低值。(3)給藥后,模型對(duì)照組24 h尿白蛋白量逐漸升高,并于造模第4周達(dá)到高峰,同一時(shí)間點(diǎn)的醋酸潑尼松組、CN各劑量組明顯低于模型對(duì)照組,與模型對(duì)照組相比較,24 h尿白蛋白,血清白蛋白,總膽固醇,尿素氮,甘油三酯,肌酐的含量變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光鏡下可見模型對(duì)照組有明顯損傷,與模型對(duì)照組比較,CN各劑量組的腎損傷有所改善,給予CN的各劑量組的α-SMA蛋白水平均明顯降低,CN高劑量組效果更佳,E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著升高。結(jié)論:1采用分兩次尾靜脈注射阿霉素的方法,可以成功地復(fù)制阿霉素腎病綜合征模型,且所用時(shí)間較短,與人類腎病綜合征表現(xiàn)更為接近。2鱷嘴花可以改善腎病綜合征的高蛋白尿癥狀,減輕腎臟損傷,延緩腎病綜合征腎小管上皮轉(zhuǎn)分化腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。3鱷嘴花可以通過上調(diào)腎組織中E-cadherin蛋白含量的表達(dá),下調(diào)α-SMA蛋白水平,抑制腎病綜合征大鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞分化,從而延緩腎間質(zhì)纖維化。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1 腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中作用EMT 主要表現(xiàn)為：細(xì)胞形態(tài)的改變，E-cadherin 表達(dá)量的減少，基底膜斷裂α-SMA 蛋白的重新表達(dá)，肌動(dòng)蛋白微絲重組以及細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)性增加。其中以細(xì)胞形態(tài)的改變、E-cadherin 含量表達(dá)的減少和α-SMA 的重新表達(dá)作為 EMT 的重要志（見圖 2）。E-黏性蛋白表達(dá)的下調(diào)和α-SMA 的上調(diào)是 EMT 的特征性標(biāo)志之一。

圖 2 腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）的表現(xiàn)鱷嘴花作為一味治療腎臟疾病的新中藥，其藥效作用及作用機(jī)制鮮有報(bào)道，作用機(jī)制更是尚未明確。本文首次采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)從 EMT 信號(hào)通路角度全面闡明了鱷嘴花鮮藥水提取物改善阿霉素（ADR）引起的 NS 腎臟纖維化的分子機(jī)制此外，本文還從整體、細(xì)胞、分子三個(gè)層次，從細(xì)胞黏附分子α-SMA、E-cadherin 角度深入研究了鱷嘴花對(duì)腎損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為腎臟疾病的治療提供了新的思路。本課題通過阿霉素 NS 大鼠模型，以活血藥鱷嘴花為代表，考查鱷嘴花對(duì) NS 大鼠的藥效作用，并應(yīng)用 Western blotting 法測(cè)定鱷嘴花對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞黏性分子α-SMA、E-cadherin 蛋白含量表達(dá)的影響，探討了鱷嘴花對(duì) NS 的作用機(jī)理，是本課題的創(chuàng)新之處，為鱷嘴花的臨床應(yīng)用及發(fā)展奠定了一定的基礎(chǔ)。

CN 高劑量組圖 3 鱷嘴花對(duì) HK-2 細(xì)胞1.3.2 鱷嘴花藥液對(duì) TGF-β1誘導(dǎo) HK-2 細(xì)CN 含藥血清干預(yù) 24 h、48 h、72 h 的經(jīng)單因素方差分析，24 h 五組間 OD ＜0.05），五組間的均值總體比較有統(tǒng)計(jì)經(jīng) Dunnett’s -T3 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，與空白
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2884275