多穗柯無(wú)色花青素還原酶基因的克隆及其表達(dá)與根皮苷含量的相關(guān)性分析
【部分圖文】：
各多穗柯樣品按“2.5.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，以“2.5.3”項(xiàng)色譜方法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程，計(jì)算各樣品中根皮苷含量。根皮苷對(duì)照品及樣品1的UPLC色譜圖見(jiàn)圖1。3 結(jié)果與分析
在線軟件ProtParam分析的結(jié)果顯示，多穗柯LAR蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)（pI）為5.32，為酸性蛋白；相對(duì)分子質(zhì)量為38 647.18；在體外紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為35.30，屬于穩(wěn)定蛋白；親水性的平均值為-0.085，屬于親水性蛋白；脂肪系數(shù)為93.89，富含異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、天冬氨酸（Asp）。SOMPA軟件對(duì)LAR基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白含α螺旋（alpha helix)121個(gè)，占34.57%；延伸鏈（extended strand)70條，占20%；β轉(zhuǎn)角（beta turn)20個(gè)，占5.71%；無(wú)規(guī)卷曲（random coil)139個(gè)，占39.71%。PROSITE程序預(yù)測(cè)該蛋白具有1個(gè)NAD(P）結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)賴氨酸活性位點(diǎn)。對(duì)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白屬于PCBER＿SDR＿a家族。結(jié)合同源建模的方法，以3i52.1.A為模板蛋白，運(yùn)用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)多穗柯LAR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明LAR蛋白以無(wú)規(guī)卷曲和α螺旋為主，兼有少量的延伸鏈和β轉(zhuǎn)角，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。TargetP 1.1 Server在線工具分析，多穗柯LAR定位于細(xì)胞質(zhì)中，預(yù)測(cè)可靠性等級(jí)為5.14，而且SignalP 3.0 Server在線分析表明，多穗柯LAR基因編碼的蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽。經(jīng)過(guò)對(duì)多穗柯LAR氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示多穗柯LAR基因編碼的多肽不存在跨膜區(qū)。
將多穗柯LAR與GenBank中登載的19種其他物種的LAR蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建LAR的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。在雙子葉植物內(nèi)部，多穗柯LAR蛋白與同為殼斗科的栓皮櫟Quercus suber L.親緣關(guān)系最近，首先聚為一支，支持率達(dá)97%，隨后與楊柳目的黑楊Populus nigra Linn.、鼠李目的棗Ziziphus jujube Mill.、薔薇目的蘋(píng)果Malus domestica Mill.、錦葵目的可可等聚為一個(gè)大分支，與桃金娘目的大桉Eucalyptus grandis Hill ex Maiden親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與外類(lèi)群人、原生生物格氏奈氏菌（Naegleria gruberi strain NEG-M）、假單胞菌病毒D3(Pseudomonas virus D3）和陰溝腸桿菌復(fù)合體SP.Enterobacter cloacae complex sp.分別聚為一個(gè)分支，這與傳統(tǒng)的分類(lèi)結(jié)果相符，也暗示了多穗柯LAR基因與其他植物的LAR基因具有共同的進(jìn)化起源。3.4 多穗柯LAR基因的表達(dá)及其與根皮苷含量的相關(guān)性分析
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