人類對(duì)抗生素的濫用,催生了超級(jí)細(xì)菌,多種無法得到有效治療的多重耐藥菌已經(jīng)出現(xiàn),極大威脅了人類的健康,是全人類所面臨的重大問題。在2016年G20峰會(huì)上抗生素耐藥性的話題已經(jīng)上升到了國(guó)際高度,成為一個(gè)等同于氣候變化和恐怖主義的世界性問題,雖然也有新的抗菌藥物陸續(xù)研發(fā)以抵制耐藥菌,但由于研究周期長(zhǎng)、難度大、研究成本高等原因進(jìn)展緩慢,更嚴(yán)重的是,許多抗生素還沒有上市即發(fā)現(xiàn)耐藥菌,因此單純依靠研發(fā)新抗菌藥物并不能及時(shí)有效地遏制細(xì)菌耐藥的進(jìn)程。所以,探討逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性,恢復(fù)耐藥菌對(duì)抗生素的敏感性是最經(jīng)濟(jì)、快速的應(yīng)對(duì)策略。中藥在現(xiàn)代預(yù)防和控制細(xì)菌性感染疾病方面具有重要作用。目前發(fā)現(xiàn)清熱解毒、清熱燥濕等中藥具有抗菌及逆轉(zhuǎn)耐藥作用,如蘆亞君等研究了三黃湯、黃連解毒湯和五味消毒飲三方均能使產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌部分或全部逆轉(zhuǎn)恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性。痰熱清注射液主要包括黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹,屬于中藥復(fù)方制劑,具有清熱化痰、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用,臨床上主要用來治療呼吸道致病菌(金黃色葡萄球菌,肺炎雙球菌等)所致的呼吸道感染,其中金黃色葡萄球菌是主要致病菌。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告,由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位,僅次于大腸桿菌。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcu saureus,MRSA)數(shù)量激增,MRSA的流行是一個(gè)嚴(yán)重的臨床醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生問題。美國(guó)每年因MRSA感染導(dǎo)致死亡的患者數(shù)相當(dāng)于艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)和病毒性肝炎(Viral hepatitis,AVH)的總和。我們前期的工作基礎(chǔ)表明,痰熱清具有抑制MRSA細(xì)菌生物膜的形成,與抗生素萬古霉素聯(lián)用有協(xié)同增效作用,但對(duì)于其能否改變MRSA的耐藥性尚需進(jìn)一步研究。因此在本研究中我們觀察了其對(duì)于臨床來源MRSA的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。本研究主要分為四部分,從表型及耐藥基因角度探討了TRQ(TanReQing)對(duì)MRSA耐藥逆轉(zhuǎn)作用:一、表型研究-痰熱清注射液對(duì)臨床分離耐藥菌(MRSA)的逆轉(zhuǎn)作用研究本實(shí)驗(yàn)部分主要是用MIC(Medium Interface Connector)值表征臨床分離MRSA逆轉(zhuǎn)前后耐藥性的變化,MIC值高表示耐藥性強(qiáng),反之表示耐藥性變?nèi)趸蚍悄退?所以,使用MIC值可表示TRQ有無逆轉(zhuǎn)作用。二、痰熱清誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)臨床分離耐藥菌逆轉(zhuǎn)作用的遺傳穩(wěn)定性研究當(dāng)TRQ對(duì)臨床分離MRSA產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用之后,主要的問題便是其遺傳穩(wěn)定性研究,針對(duì)此問題,我們分別進(jìn)行了連續(xù)空白培養(yǎng)10代和相關(guān)抗生素反復(fù)誘導(dǎo)5代兩方面研究,根據(jù)觀察MIC變化確定其遺傳穩(wěn)定性,若連續(xù)空白培養(yǎng)10代后和抗生素誘導(dǎo)耐藥5代前后的MIC值無大的差異,證明逆轉(zhuǎn)具有遺傳穩(wěn)定性。三、運(yùn)用基因檢測(cè)方法對(duì)耐藥菌中抗性基因進(jìn)行了機(jī)制探討MRSA產(chǎn)生耐藥性的原因分為獲得性耐藥和固有耐藥,這兩種來源均離不開DNA的轉(zhuǎn)化或介導(dǎo),即離不開相關(guān)基因的變化,所以,可以通過監(jiān)測(cè)逆轉(zhuǎn)前后菌株中基因的變化進(jìn)行機(jī)制探討。四、運(yùn)用分子克隆技術(shù)對(duì)耐藥菌中相關(guān)耐藥基因進(jìn)行了機(jī)制探討基于上述對(duì)抗性基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們挑選了幾個(gè)耐氨基糖苷類抗生素基因運(yùn)用分子克隆技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)研究。結(jié)果表明,在表型實(shí)驗(yàn)中,其逆轉(zhuǎn)后的臨床分離MRSA對(duì)各臨床常用抗生素MIC值較逆轉(zhuǎn)前有明顯的降低,特別對(duì)于氨基糖苷類抗生素尤為明顯,在進(jìn)一步的機(jī)制研究中,在誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)前后,多種耐藥基因發(fā)生變化,消失或減少。而利用分子克隆技術(shù)將相關(guān)耐藥基因(aacA)引入至感受態(tài)細(xì)胞后,其表型(MICs)表現(xiàn)是發(fā)生增大變化的,表明臨床MRSA的耐藥性與此耐藥基因有關(guān)。綜合以上所述,痰熱清注射液對(duì)臨床分離MRSA具有誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)作用,并通過改變部分耐藥基因而使其耐藥性降低,為臨床耐藥菌引起的細(xì)菌感染性疾病提供新的方法及思路,指導(dǎo)臨床用藥選擇(提高治愈率、減少死亡率等)、優(yōu)化抗菌藥物的使用方法、基于機(jī)制的探討有助于新藥開發(fā)等。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

血瓊脂基礎(chǔ) (OXOID)。實(shí)驗(yàn)用抗生素具體分類如圖 1.1 所示。圖.1-1 實(shí)驗(yàn)所用抗生素分類及名稱Fig. 1-1 Classification and name of antibiotics used in the experiment

A、FOX、OX、CIP、LZD、SM、P、E、RD、TE 對(duì)各原IC 值。取無菌 96 孔平底微量板，按照溶液 2 倍稀釋法稀釋度為 16500、 8250、 4125、 2063、 1032、 516、 258、設(shè)定陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔，其中陰性對(duì)照孔中含 200100μL LB 培養(yǎng)基和 100μL OD600=0.02 的菌液， 置 37孔加入 0.25% TTC 30μL，繼續(xù)培養(yǎng) 0.5 h。 顯現(xiàn)紅色為有提下，判斷藥物的 MIC 值。記錄結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù) 法工作臺(tái)中，挑取以上 7 株耐藥菌菌株于裝有 3-5mL MH 肉件的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16-18h，培養(yǎng)完成后，測(cè)定其為 0.2，備用。TRQ 濃度參考前期實(shí)驗(yàn)選擇為 4096μg/mL 稀釋藥液 1:1 混勻（V:V=1.5:1.5），于 280rpm、37℃條件h，最后于超凈臺(tái)中涂布菌液以生長(zhǎng)（16-18h）保存菌落，，4℃保存?zhèn)溆�。具體流程見下圖。

圖 1.3 MIC 值變化（臨床分離耐藥菌 1611017 經(jīng) TRQ 誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)至 5 代）MIC value changes (clinical isolation of drug-resistant strain 1611017 was reversed generations)表 1-2 MIC 值變化（臨床分離耐藥菌 1611017 經(jīng) TRQ 誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)至 5 代）MIC value changes (clinical isolation of drug-resistant strain 1611017 was reversedgenerations)轉(zhuǎn)代數(shù) R0 R1 R2 R3 R4 μg/mL） 512 2 256 512 512 RD
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2 倪健聰,劉運(yùn)國(guó);力確興對(duì)臨床分離耐藥菌體外抗菌作用研究[J];中國(guó)藥業(yè);1998年09期

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本文編號(hào)：2884096