發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 01:29

　　 建立氣相和液相色譜方法用于鑒定α-沒藥醇(α-bisabolol)絕對(duì)構(gòu)型,確定青蒿α-bisabolol合酶產(chǎn)物的絕對(duì)構(gòu)型.手性液相方法分離并制備α-bisabolol的4種立體異構(gòu)體,結(jié)合旋光度測定、氣相色譜和標(biāo)準(zhǔn)品確定4種立體異構(gòu)體的絕對(duì)構(gòu)型.分別建立氣相和液相色譜2種方法來鑒定α-bisabolol的4種立體異構(gòu)體混合物.化學(xué)合成酶促反應(yīng)的底物法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP),原核表達(dá)、蛋白純化后進(jìn)行體外催化,鑒定2個(gè)α-bisabolol合酶體外催化產(chǎn)物α-bisabolol的絕對(duì)構(gòu)型.甜舌草α-bisabolol合酶(Lippia dulcis bisabolol synthase,LdBOS)體外催化FPP,產(chǎn)物構(gòu)型為(+)-epi-α-bisabolol,與文獻(xiàn)報(bào)道一致.青蒿α-bisabolol合酶(Artemisia annua bisabolol synthase,AaBOS)體外催化FPP生成的產(chǎn)物為(+)-α-bisabolol.Agilent CP-Chirasil-Dex-CB氣相色譜柱和Chiralpak IA液相色譜柱可分別用以分離、鑒定α-bisabolol的4種手性異構(gòu)體.AaBOS和LdBOS的催化產(chǎn)物6位碳構(gòu)型相同,暗示這2種酶與青蒿紫穗槐二烯合酶(Artemisia annua amorpha-4,11-diene synthase,AaADS)的催化機(jī)理類似.利用氣相和液相色譜的方法分析手性化合物,具有靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、簡便易行等優(yōu)點(diǎn).手性化合物α-bisabolol絕對(duì)構(gòu)型的分離、鑒定,在醫(yī)藥、食品和化工領(lǐng)域具有重要意義.
【部分圖文】：

如圖1所示，倍半萜醇α-bisabolol具有2個(gè)手性中心，因此存在4種立體異構(gòu)體，它們分別由不同的倍半萜合酶催化產(chǎn)生，現(xiàn)已從相應(yīng)的精油組分中分離得到．（-）-α-bisabolol是洋甘菊精油的主要成分，因其具有消炎、殺菌、抗癌活性，在醫(yī)藥化工行業(yè)有重要應(yīng)用．目前化學(xué)合成的α-bisabolol通常是幾種異構(gòu)體的混合物，據(jù)報(bào)道，左旋異構(gòu)體（-）-α-bisabolol的藥理活性明顯優(yōu)于右旋異構(gòu)體（+）-α-bisabolol和合成的α-bisabolol[3]．從美洲熱帶地區(qū)本土植物甜舌草葉片中提取得到的（+）-epi-α-bisabolol是一種特別的甜味劑[4]，可作為蔗糖的完美替代品，降低由于人們食物中攝取過多的糖分而導(dǎo)致的肥胖、患糖尿病的幾率，值得注意的是，關(guān)于bisabolol潛在藥效的報(bào)道均未提及其絕對(duì)構(gòu)型，其原因是尚無簡便易行的構(gòu)型確定方法．α-bisabolol 4種異構(gòu)體的分離一直是人們關(guān)注的問題，1993年，Yasuyuki等利用1 H和13 C核磁共振波譜，結(jié)合高效液相色譜和旋光度檢測，對(duì)玫瑰腺毛分泌物中的（+）-epi-α-bisabolol和商品化標(biāo)準(zhǔn)品（-）-α-bisabolol進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定[5].1994年，Wilfried等以環(huán)糊精作為固定相制備氣相色譜柱，首次實(shí)現(xiàn)了α-bisabolol 4種異構(gòu)體的分離[2]．青蒿α-bisabolol合酶（Artemisia annua bisabolol synthase,AaBOS)[6]和甜舌草α-bisabolol合酶（Lippia dulcis bisabolol synthase,LdBOS）均可催化法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate,FPP）生成α-bisabolol,Attia等[7]通過氣、液相色譜方法，結(jié)合核磁共振波譜確定了LdBOS催化產(chǎn)物α-bisabolol的絕對(duì)構(gòu)型為（4R,8S)-bisabolol((+)-epi-α-bisabolol）．根據(jù)（±）-α-bisabolol和（±）-epi-α-bisabolol的物化性質(zhì)略有不同，利用非手性氣相色譜柱可實(shí)現(xiàn)2對(duì)非對(duì)映體混合物的分離[8]，但是對(duì)映體的分離必須依靠手性填料柱完成，很難推廣．本研究旨在建立利用商品化色譜柱對(duì)α-bisabolol的4種立體異構(gòu)體混合物進(jìn)行分離鑒定的氣相和液相色譜方法，同時(shí)利用此方法鑒定絕對(duì)構(gòu)型尚未確定的青蒿α-bisabolol合酶產(chǎn)物的絕對(duì)構(gòu)型．

α-bisabolol標(biāo)準(zhǔn)品和（-）-α-bisabolol標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜分析結(jié)果見圖2．α-bisabolol標(biāo)準(zhǔn)品手性液相分離結(jié)果顯示有4個(gè)組分，分別是圖1中a、b、c、d，其中峰c與（-）-α-bisabolol標(biāo)準(zhǔn)品的峰e(cuò)相對(duì)應(yīng)，說明c為（-）-α-bisabolol.2.1.2 α-bisabolol 4種立體異構(gòu)體的旋光度測定結(jié)果

液相制備所得4個(gè)組分，旋蒸處理后由色譜級(jí)正己烷溶解，非手性柱（Rtx-5）氣相色譜分析后的樣品進(jìn)一步經(jīng)氣相質(zhì)譜檢測，分析結(jié)果見圖3．非手性柱無法分離對(duì)映體，但是根據(jù)（±）-α-bisabolol和（±）-epi-α-bisabolol的物化性質(zhì)略有不同，利用非手性柱可實(shí)現(xiàn)2對(duì)非對(duì)映體混合物的分離，峰a和峰c為α-bisabolol對(duì)映體，依旋光度測定結(jié)果，確定c為（-）-α-bisabolol,a為（+）-α-bisabolol；峰b和峰d為epi-α-bisabolol對(duì)映體，依旋光度測定結(jié)果，確定b為（-）-epi-α-bisabolol,d為（+）-epi-α-bisabolol．由此，確定了液相分離得到的α-bisabolol 4種立體異構(gòu)體的構(gòu)型，可作為標(biāo)樣做進(jìn)一步研究．嘗試了幾種手性柱，只有Agilent CP-Chirasil-Dex-CB能將4種α-bisabolol立體異構(gòu)體分開，氣相分析結(jié)果見圖4.
【相似文獻(xiàn)】

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3 陳金杰;高異黃酮及當(dāng)歸貝母苦參方的有效部位研究[D];浙江大學(xué);2014年

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