阿爾茨海默病(AD)是一種起病隱匿、原發(fā)性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,俗稱老年癡呆,主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性語言、記憶障礙;人格改變;認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)精神癥狀,嚴(yán)重影響患者的職業(yè)生涯、正常社交及生活能力。其特征性病理改變主要有:β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的細(xì)胞外老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)等�！癆β假說”即由于機體代謝異常,不能被及時清除的Aβ蛋白在腦內(nèi)特定區(qū)域沉積,引起神經(jīng)元死亡,導(dǎo)致AD。石菖蒲,屬天南星科植物,其干燥根莖亦稱石菖蒲,味辛性溫,具有開竅祛痰、除濕健胃、益智醒神的功效。在臨床上常治療癲癇、老年性癡呆、健忘癥、中風(fēng)失語等疑難雜癥。石菖蒲的揮發(fā)油提取物在改善小鼠的學(xué)習(xí)、記憶方面具有顯著功效。近年來,在神經(jīng)系統(tǒng)方面,與石菖蒲相關(guān)的研究越來越多,而石菖蒲揮發(fā)油對AD治療作用的研究還較少。本研究用石菖蒲揮發(fā)油對AD模型小鼠進(jìn)行實驗研究,觀察石菖蒲揮發(fā)油對AD模型小鼠神經(jīng)元損傷的保護作用及可能的機制,為石菖蒲揮發(fā)油改善及治療AD提供實驗依據(jù)。目的:本實驗通過探討石菖蒲揮發(fā)油對AD模型小鼠神經(jīng)元損傷的保護作用,研究石菖蒲揮發(fā)油提取物對AD的改善作用及相關(guān)機制探討。方法:藥材為正品的石菖蒲干燥根莖,中草藥粉碎機打碎成能過2號篩(20目)粗粉;每個1000 ml的圓底燒瓶中加200 g石菖蒲粗粉、1000 ml水、5粒沸石,靜置浸泡1 h,揮發(fā)油測定儀器提取,至石菖蒲揮發(fā)油不再增多,關(guān)閉加熱套電源,停止加熱。昆明小鼠隨機分為正常組(空白對照組)、手術(shù)對照組、模型組(Aβ組)、治療組,其中治療組又分為治療組I Aβ+2.5μL石菖蒲揮發(fā)油/10 g b.w.和治療組II Aβ+5μL石菖蒲揮發(fā)油/10 g b.w.兩組。用腦立體定位儀,向模型組和治療組小鼠大腦的雙側(cè)海馬區(qū),微量注射寡聚態(tài)Aβ_(1-42),建造AD小鼠模型;相同方法,手術(shù)對照組微量注射等量的生理鹽水,正常組不做處理。造模七天后,新穎物體識別實驗篩選出認(rèn)知和記憶功能障礙的造模成功小鼠,之后治療組開始灌胃給藥,治療組I、II灌胃劑量分別為:2.5μL石菖蒲揮發(fā)油/10 g b.w.和5μL石菖蒲揮發(fā)油/10 g b.w.,手術(shù)對照組、模型組灌胃相同量生理鹽水,連續(xù)灌胃三周;再次做新穎物體識別實驗,行為學(xué)分析給藥石菖蒲揮發(fā)油對各組小鼠的記憶和認(rèn)知功能的影響。HE染色,觀察各組海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)變化。免疫組織化學(xué)(IHC)法,檢測不同組小鼠海馬內(nèi)Aβ的沉積以及DCX、Nestin、BDNF、TrkB、NT3的表達(dá)。Western blot,檢測Nestin、DCX、BDNF、NT3、TrkB的表達(dá)。結(jié)果:1、新穎物體識別實驗結(jié)果表明,正常組和手術(shù)對照組小鼠的認(rèn)知指數(shù)無顯著差異(P0.05),而模型組小鼠的認(rèn)知指數(shù)明顯下降(P0.01),表明其認(rèn)知功能明顯衰減;與模型組相比,治療組小鼠的認(rèn)知指數(shù)顯著增加(P0.05),提示治療組小鼠的認(rèn)知功能有所改善。2、HE染色結(jié)果表明,與正常組相比,手術(shù)對照組小鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞并無嚴(yán)重?fù)p傷,僅針道附近細(xì)胞排列紊亂;與正常組和手術(shù)對照組相比,模型組小鼠大腦海馬區(qū)損傷嚴(yán)重,海馬齒狀回細(xì)胞形態(tài)改變,主要表現(xiàn):神經(jīng)元胞核深染、胞核固縮,細(xì)胞排列疏松紊亂,且細(xì)胞胞體與周圍組織脫離;以AD模型組為對照,治療組有所改善。3、免疫組織化學(xué)結(jié)果表明,正常組和手術(shù)對照組小鼠大腦海馬區(qū)幾乎檢測不到Aβ沉積;模型組海馬區(qū)有大量Aβ斑塊沉積;與模型組相比,治療組小鼠大腦海馬區(qū)Aβ斑塊沉積含量明顯降低。4、DCX、Nestin的免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果表明,與正常組相比,手術(shù)對照組小鼠大腦中DCX、Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)量無顯著性差異(P0.05);而模型組小鼠大腦中DCX、Nestin的陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組相比,治療組小鼠大腦中二者的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5、BDNF、TrkB的免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果表明,手術(shù)對照組和正常組小鼠大腦中BDNF、TrkB的陽性細(xì)胞表達(dá)量無顯著性差異(P0.05);模型組大腦中BDNF、TrkB的陽性細(xì)胞表達(dá)量與正常組相比明顯降低,統(tǒng)計學(xué)分析具有差異性(P0.05);以模型組為對照,治療組小鼠大腦中二者陽性細(xì)胞表達(dá)量都明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組中,BDNF、TrkB陽性細(xì)胞表達(dá)量的趨勢是一致的。6、NT3的免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果表明,與正常組相比,手術(shù)對照組小鼠大腦中NT3的含量無顯著性差異(P0.05);而模型組小鼠大腦中NT3陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯減少,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果具有顯著性差異(P0.001);以模型組為對照,治療組小鼠大腦中NT3的表達(dá)量顯著增加,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1、海馬區(qū)微量注射Aβ_(1-42)可誘導(dǎo)小鼠大腦出現(xiàn)一系列類AD相關(guān)的病理變化及認(rèn)知功能障礙。2、石菖蒲揮發(fā)油可能改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能。3、石菖蒲揮發(fā)油治療后,DCX、Nestin陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目明顯增加,提示石菖蒲揮發(fā)油可能誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元的再生;其可能通過上調(diào)BDNF、TrkB、NT3表達(dá),促進(jìn)和保護小鼠海馬神經(jīng)元的生長。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5;R-332
【部分圖文】：

提�。▍⒖� 2015 版中國藥根莖使其能通過二號篩，混-1 所示，A 為硬質(zhì)的圓底燒1 ml 刻度）、冷凝回流管 C。儀器都應(yīng)該是清洗干凈且干止揮發(fā)油揮發(fā)出來。，提取石菖蒲揮發(fā)油采用此在 1.0 以下的揮發(fā)油，稱取石水適量，玻璃珠數(shù)粒，防止水使充滿揮發(fā)油測定器的整電熱套中加熱至沸騰，并保閉電源停止加熱，放置自然 0 刻度線上 5 mm 時關(guān)閉活度，計算石菖蒲揮發(fā)油的含

臺盼藍(lán)的小鼠大腦進(jìn)行切片，確定實驗造 AD 模型右旁開 1.5 mm，進(jìn)針 2.3 mm。提前準(zhǔn)備好實驗所需儀器及試劑，調(diào)試固定腦平頭微量注射器以及顱骨鉆等儀器，設(shè)置微量注射醉小鼠，腹腔注射，劑量為 0.015 ml/g 體重。麻醉小鼠顱骨保持水平，剔除小鼠頭頂?shù)氖竺妹藁餍∈箢^頂沿正中矢狀方向劃開一道長約 1.5 cm 的鉆在小鼠大腦前囟后 2.3 mm，左右旁開 1.5 mm，示）輕緩打孔，使用平頭微量注射器向小鼠海馬內(nèi)側(cè)海馬注射（如圖 2-3 B 所示）。注射時，平頭微量注注射時間 2 min，留針 5 min，保證藥液完全浸入，再停頓留針 4 min，待 Aβ1-42工作液在小鼠海馬內(nèi)針至平頭微量注射器全部拔出。在針孔處涂抹青霉把傷口皮膚縫合，再次涂抹青霉素鈉干粉消炎，最連續(xù)注射 3 天，防止小鼠術(shù)后發(fā)炎感染。

圖 2-3 腦立體定位儀微量注射 Aβ1-42Fig. 2-3 Microinjection ofAβ1-42by stereotaxis2.2.4 新穎物體識別實驗建造模型后第七天和灌胃石菖蒲揮發(fā)油3周以后分別進(jìn)行行為學(xué)新穎物體識別實驗。相對于熟悉的物體，小鼠對陌生的新穎物體具有更強的好奇心，相應(yīng)的探索時間就會越長。一個紙質(zhì)的測試敞箱、2 套不同的測試物體（相似的小鼠喜好程度，每套兩個相同物體）組成了本實驗的裝置。測試敞箱為 0.6 m × 0.6 m × 0.6 m 的紙箱，底面平鋪一層小鼠墊料；A、B 兩套測試物體的顏色、材質(zhì)均不同，高度約為 10cm，均需有一定的重量，防止被小鼠移動。該實驗包括適應(yīng)期、熟悉期、測試期三個階段，整個實驗過程應(yīng)保持燈光微暗且環(huán)境安靜，防止小鼠的自主行為受到干擾。為避免實驗過程中小鼠的氣味等信號會影響下一只小鼠的行為，每只小鼠測試完成后均應(yīng)對測試敞箱的墊料進(jìn)行更換。適應(yīng)期：將小鼠放置于測試敞箱的正中，除底面平鋪一層墊料外不放其他任何物
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳雙慶;黃敏;劉晨鷺;沈玉英;蔡慶;王培軍;;Wnt/β-連環(huán)素與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶信號通路介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2017年41期

2 曾維軍;周文勝;王佳;;神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子在神經(jīng)干細(xì)胞中的研究進(jìn)展[J];臨床與病理雜志;2015年03期

3 付學(xué)軍;黃巧英;徐鉛輝;鄒良玉;張睿;褚曉凡;;持續(xù)腦缺血后半暗帶區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年05期

4 閆娟娟;劉明;胡園;余冰穎;張剛強;劉屏;;定志小丸對東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及機制[J];中國中藥雜志;2012年21期

5 李清山;楊威;潘艷芳;閔婕;張喆;高慧中;祁金順;;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子拮抗β淀粉樣蛋白所致大鼠在體海馬長時程增強的傷害[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2012年05期

6 匡忠生;江湧;李志強;王淑英;謝宇暉;;石菖蒲提取成分對大鼠腦皮質(zhì)NMDA、M受體與其配體結(jié)合的影響[J];中藥新藥與臨床藥理;2010年04期

7 江湧;方永奇;李小兵;李翎;蔣紅蘭;;β-細(xì)辛醚對AD大鼠海馬神經(jīng)元蛋白質(zhì)組圖譜的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年09期

8 李福勝;王靜;何明大;;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對阿爾茨海默病的作用[J];實用預(yù)防醫(yī)學(xué);2007年04期

9 江湧;何玉萍;鄒衍衍;方永奇;;β-細(xì)辛醚對癡呆小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[J];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

10 方永奇,李翎,吳啟端,鄒衍衍,魏剛,林雙鋒;β-細(xì)辛醚和冰片對大鼠缺血再灌注腦損傷的保護作用[J];中國中醫(yī)藥科技;2004年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 盧圓圓;石菖蒲化學(xué)成分及藥理活性研究[D];華中科技大學(xué);2016年

2 汪建成;中間絲蛋白Nestin調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用機理研究[D];中山大學(xué);2016年

3 韋朝霞;BDNF-TrkB通路在海馬腦片培養(yǎng)中的神經(jīng)再生研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 鄭瑞;硒代蛋氨酸對AD小鼠腦內(nèi)神經(jīng)再生的影響[D];深圳大學(xué);2017年

本文編號：2882830