目的探究木犀草素(luteolin)對腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)機制。方法通過靶向藥物評分方法篩選出對腦缺血再灌注損傷具有潛在治療效果的抗氧化劑并在大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型中驗證木犀草素的保護(hù)效果;在缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(oxygen/glucose deprivation and re-oxygen/glucose,OGD/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中使用不同濃度(10和50μmol/L)木犀草素藥物處理,檢測MTT細(xì)胞活力及氧自由基ROS含量變化;通過免疫熒光、蛋白印跡等方法檢測木犀草素處理后OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬流情況及線粒體形態(tài)變化,觀察木犀草素對OGD/R后ROS生成和清除過程的影響。結(jié)果木犀草素對腦缺血再灌注靶向藥物評分為96.86分。TTC染色結(jié)果顯示木犀草素明顯減少MCAO小鼠腦梗死面積(P0.05)。OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞MTT值約為正常對照組的50%,使用50μmol/L的木犀草素處理后MTT值增加至83%(P0.05),并且木犀草素顯著減弱OGD/R誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生,且呈劑量依賴性(P0.05)。激光共聚焦結(jié)果顯示50μmol/L木犀草素處理OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞后自噬小體熒光強度增高64.6%(P0.05),自噬小體與溶酶體共定位情況提高1.56倍(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示木犀草素明顯抑制OGD/R后Drp1 Ser616磷酸化水平及Drp1線粒體轉(zhuǎn)位(P0.05),改善OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體形態(tài)(P0.05)。結(jié)論木犀草素對于腦缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷具有明顯保護(hù)作用,一方面它可以通過改善自噬流過程促進(jìn)線粒體自噬小體的降解,加速ROS的清除效率;另一方面它還可以通過抑制Drp1活性保護(hù)線粒體形態(tài),減少ROS的產(chǎn)生。
【部分圖文】：

表1 腦缺血再灌注損傷抗氧化劑靶向藥物篩選 分?jǐn)?shù) Pubchem ID號 名稱 功能描述 90.57 BRD-K19220233 JNK-9L JNK/p38抑制劑 91.62 BRD-K00317371 RITA MDM抑制劑 91.90 BRD-K91623615 ABT-751 Tubulin微管抑制劑 92.24 BRD-K92991072 PAC-1 Caspase激動劑 93.38 BRD-K63606607 bufalin(布法林) ATPase抑制劑 93.39 BRD-K88568253 iproniazid(異丙嗪) 單胺氧化酶抑制劑 93.64 BRD-K59753975 vindesine(長春地辛) Tubulin微管抑制劑 94.42 BRD-A13122391 triptolide(雷公藤內(nèi)酯) RNA聚合酶抑制劑,具有抗炎效果 94.79 BRD-A24543851 nornicotine(去甲煙堿) 乙酰膽堿受體激動劑 95.79 BRD-K82109576 vincristine(長春新堿) Tubulin微管抑制劑 95.94 BRD-U82589721 HG-5-113-01 蛋白激酶抑制劑 96.73 BRD-K79090631 CGP-60474 CDK /VEGFR-2 /PKC抑制劑 96.86 BRD-M16762496 luteolin(木犀草素) PIK-75/蛋白激酶抑制劑/PI3K抑制劑 97.96 BRD-U51951544 ZG-10 JNK/p38抑制劑 97.99 BRD-A11702965 chromomycin-a3 DNA結(jié)合劑圖2 木犀草素對OGD/R處理SH-SY5Y細(xì)胞活力及ROS產(chǎn)生的影響

木犀草素對OGD/R處理SH-SY5Y細(xì)胞活力及ROS產(chǎn)生的影響

進(jìn)一步觀察木犀草素對OGD/R后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響,結(jié)果顯示,OGD/R后活化Drp1發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位后會造成線粒體碎片化,導(dǎo)致破損線粒體數(shù)量增加,線粒體長度明顯縮短(P<0.05),而木犀草素處理后線粒體形態(tài)和數(shù)量明顯改善(P<0.05,圖5D～E),提示木犀草素可以通過抑制Drp1活性減少破損線粒體的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制了OGD/R后ROS的過度生成。結(jié)果顯示木犀草素除了可以通過改善自噬流增加OGD/R后ROS的清除效率,還可通過保護(hù)線粒體形態(tài)減少ROS產(chǎn)生,而這個過程可能與木犀草素對線粒體分裂蛋白Drp1的活性抑制有關(guān)。圖4 木犀草素對OGD/R后自噬小體和自噬溶酶體形成的影響
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