背景:我國(guó)慢性病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的86.6%;大量研究表明,抗氧化應(yīng)激是控制慢性病發(fā)生和發(fā)展的重要因素;抗氧化劑可以用來(lái)緩解氧化應(yīng)激的發(fā)生,但是目前人工合成抗氧化劑的安全性受到了大家廣泛的質(zhì)疑,因此尋找安全有效的天然抗氧化劑是亟待解決的問(wèn)題;烏欖葉全年可采收,資源豐富,研究發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的清除氧自由基、抗衰老作用,但對(duì)其藥效和機(jī)制未進(jìn)行深入研究;因此研究烏欖葉抗氧化作用并初步推斷其作用機(jī)制具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。目的:本研究針對(duì)烏欖葉的成分和在體內(nèi)外抗氧化活性進(jìn)行初步的探討,旨在為烏欖葉的開(kāi)發(fā)和天然抗氧化劑的研究提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.(1)采用比色法測(cè)定烏欖葉不同提取物中總黃酮、多酚、皂苷、多糖含量;(2)通過(guò)測(cè)定烏欖葉的自由基清除力、還原力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等,評(píng)價(jià)其抗氧化活性;(3)使用Perman分析含量與抗氧化能力的相關(guān)性。2.(1)以總黃酮的含量為指標(biāo),結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)合,確定最優(yōu)提取工藝;(2)純化得到欖葉黃酮化合物(TFCPL)后考察其抗氧化活性。3.(1)采用注射D-半乳糖方法建立氧化損傷模型小鼠,取小鼠肝臟、肺等臟器進(jìn)行HE染色并觀察;使用紫外分光光度法和酶板法測(cè)定小鼠血清、肝臟和腦中MDA含量及T-AOC、GSH-PX、SOD、TNF-α、iNOS、NO、CAT等活性;(2)采用C_(18)色譜柱,磷酸和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道并通過(guò)空白血清與口服TFCPL后的含藥血清和對(duì)照品之間的HPLC色譜圖之間的對(duì)比分析,初步推斷入血成分。結(jié)果:1.(1)CEE中總黃酮含量最高,與其他提取物有顯著差異(P0.01,P0.05);(2)CEE對(duì)DPPH·(16.31μg/ml)、ABTS~+·(0.240 mg/ml),·OH(0.170 mg/ml),還原力(0.221±0.005)和脂質(zhì)過(guò)氧化(85.84±0.35%)均有明顯的清除作用;(3)其含量與抗氧化能力具有顯著相關(guān)性(P0.01,P0.05)。2.(1)烏欖葉中總黃酮提取最佳條件為:體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇、液料比1:20、回流提取時(shí)間1.5 h、提取1次;(2)TFCPL的抗氧化活性(IC_(50)=0.065mg/mL)較維生素C持久性更高。3.(1)烏欖葉黃酮對(duì)小鼠體重沒(méi)有顯著性影響(P0.05);與模型組相比,TFCPL組具有不同程度的抑制肝臟的氣球性樣變,肺部炎性浸潤(rùn)的作用;與模型組比較,各TFCPL組血清中GSH-Px、SOD顯著升高(P0.05),MDA、TNF-α、iNOS含量顯著性降低(P0.01,P0.05);肝臟中T-AOC、GSH-Px、CAT等抗氧化酶活性明顯增強(qiáng)(P0.01,P0.05),NO含量顯著降低(P0.05);腦組織中MDA含量顯著降低P0.01,P0.05);研究發(fā)現(xiàn)烏欖葉中有4種可能是直接吸收入血的成分,提示這幾種成分可能發(fā)揮藥效。結(jié)論:1.CEE抗氧化活性最優(yōu),總黃酮含量最高。2.純化后的TFCPL抗氧化能力均大于BHT而且總抗氧化能力大于V_C。3.TFCPL可改善D-半乳糖致氧化損傷小鼠臟器的病理學(xué)變化,提高酶活性,其作用機(jī)制可能與提高抗氧化酶活力相關(guān)。4.推測(cè)TFCPL入血成分可能為牡荊素;異牡荊素;金絲桃苷;槲皮素,需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

圖 2-1(A) 烏欖葉提取物清除 DPPH·能力；圖 2-1(B) 烏欖葉提取物 DPPH·清除率的 IC50由圖 2-1 可知，烏欖葉提取物對(duì) DPPH 清除能力呈明顯的濃度依賴(lài)性，濃度為 50 μg /mL 時(shí)，NE（63.43 ± 0.45）%、EAE（69.04 ± 1.27）%、WE（67.67 ± 0.66）%、CEE（64.43 ± 1.02）% 的清除率相當(dāng)，其中烏欖葉各提取物的 IC50與 VC 均具有顯著性差異(P<0.01, P<0.05)，WE 的 IC50為 16.31，CEE 的 IC50為 17.97，其抗氧化活性相當(dāng)，約為 VC抗氧化活性的 50%。推測(cè)烏欖葉抗氧化能力可能是與DPPH 單電子的配對(duì)能力產(chǎn)生的作用。(2)ABTS+ 清除能力測(cè)定精密量取烏欖葉提取物溶液（0.05 mg/mL ~0.7 mg/mL）40 μL 后加入 ABTS+ 溶液 4 mL，渦旋 30 s，避光 10 min 后在 734 nm 處測(cè)定吸光度 A1。ABTS+ 溶液作空白，吸光度為 A2[92]；ABTS+ 的稀釋?zhuān)河?PBS 溶液稀釋 ABTS+ 工作液，在常溫下 734nm 處吸光值為 0.7±0.02 即可，對(duì) ABTS+·的清除率按照下式計(jì)算：清除率（%） (1 ) 1001AA

圖 2-2(A) 烏欖葉提取物清除 ABTS+·能力；圖 2-2(B) 烏欖葉提取物 ABTS+·清除率 IC50如圖 2-2，CEE（99.35±1.21）%清除能力與 VC（98.84±0.39）%相當(dāng)，且清除力是 WE 的 1.17 倍，PE 的 18.3 倍。由烏欖葉各提取物和 VC的 IC50值可知，NE、EAE、WE 與 VC具有顯著性差異(P<0.01, P<0.05)，但 CEE 與 VC不具有顯著性差異(P>0.05)，表明 CEE 與 VC的抗氧化活力相當(dāng)；提示烏欖葉可能通過(guò)有效成分中陰離子結(jié)合方式產(chǎn)生抗氧化作用而且 CEE 中含有與 VC相當(dāng)量的陰離子。(3) ·OH 清除能力測(cè)定基于脫氧核糖降解測(cè)定法[93]，吸取烏欖葉提取物溶液（0.05 mg/mL ~0.5mg/mL）200μL，依次加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4）600 μL，脫氧核糖（50 mmol/L）100 μL、Na2EDTA（1 mmol/L）100 μL、FeCl3（3.2 mmol/L）100 μL、H2O2（50 mmol/L）100 μL、VC（1.8 mmol/L）100 μL，定容至 1600 μL，50℃溫育 20 min，加入三氯乙酸（10 %）500 μL，5 %的 TBA300 μL，在 105 ℃加熱 15 min 顯色。冷卻后在 530 nm 處測(cè)定。

烏欖葉提取物在 0.5 mg/ml 時(shí)已達(dá)到較高清除率，結(jié)合圖2-3(B)，PE、NE、EAE、WE 與 VC抗·OH 活性具有顯著性差異（P<0.05)；EE（IC50=0.176）和 CEE（IC50=0.170）與 VC（IC50=0.168）不具有顯著性差異，表明其對(duì)·OH清除率相當(dāng)，其清除能力推測(cè)可能通過(guò)Fe2+和Cu2+(螯合離子)抑制·OH的產(chǎn)生[94]。2.2.4.2 還原力測(cè)定精密量取烏欖葉不同濃度溶液（0.025 ~0.16 mg/mL）0.5mL 與磷酸鹽緩沖液（PH=6.6, 0.2 mol/L) 2.5 mL，鐵氰化鉀（1 %）2.5 mL，混合，50 ℃保溫 20 min后，加入三氯乙酸（10 %）2.5 mL，3000 r/min 離心 10 min
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本文編號(hào)：2878960