發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 09:27

　　 心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVDs)是目前全球致死率最高的疾病,很快就會(huì)成為全球主要的健康問(wèn)題。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種進(jìn)行性疾病,其主要特征是脂質(zhì)和纖維類(lèi)物質(zhì)在大動(dòng)脈中不斷積累,它是造成心血管疾病日益增長(zhǎng)的重要原因。水蛭是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材,它具有破血、逐淤等功能,其煎劑、口服液等劑型廣泛用于心血管疾病的防治。但是其不良反應(yīng)也時(shí)有發(fā)生,其中出血不良反應(yīng)最為突出,嚴(yán)重影響患者的健康。在前期對(duì)水蛭活性成分研究的基礎(chǔ)上,我們推測(cè)可能是水蛭中的某些成分對(duì)機(jī)體的凝血因子產(chǎn)生了影響,使其凝血活性發(fā)生改變,從而導(dǎo)致了出血不良反應(yīng)。而內(nèi)皮細(xì)胞在機(jī)體凝血中有重要的作用。所以本論文以水蛭的干燥全體為原材料,采用不同的提取條件和轉(zhuǎn)化條件,以期能獲得一種既不影響內(nèi)皮細(xì)胞中凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá),又能夠抑制AS發(fā)展的水蛭制備方法,從而找到一種臨床可長(zhǎng)期用于AS的預(yù)防,安全可靠的,出血不良反應(yīng)弱的新型口服制劑。具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:1.不同條件下水蛭提取物的制備本實(shí)驗(yàn)以水蛭的干燥全體為原材料,分別用水提、胃蛋白酶酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)用雙酶解和粗酶酶解四種制備方法得到4種水蛭提取物,分別命名為水蛭粉水提物(LP)、胃蛋白酶酶解水蛭提取物(PHL)、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解的水蛭提取物(PTHL)和粗酶酶解的水蛭提取物(CEHL)。另外將得到的PHL和PTHL的水蛭提取物進(jìn)行乳酸桿菌的代謝轉(zhuǎn)化,得到了乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物(MRS)、乳酸桿菌在不含氮源的MRS培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物(MRS-1)以及乳酸桿菌在PHL作為氮源的MRS培養(yǎng)基中的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(MRS-2)和乳酸桿菌在PTHL作為氮源的MRS培養(yǎng)基中的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(MRS-3)4種提取物,共制備了 8個(gè)樣品。2.不同水蛭提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凝血活性的影響將提取得到的8個(gè)水蛭提取物作用于EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞,利用RT-PCR對(duì)EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子,包括促凝血因子PAI、vWF和抗凝血因子tPA、PS、TFPI、TMmRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0-50μg/ml的濃度范圍內(nèi),LP可以顯著促進(jìn)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá);PHL和MRS-1對(duì)EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá)均無(wú)影響;PTHL可以顯著降低EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá);CEHL可以促進(jìn)PAI和PS mRNA的表達(dá),但是對(duì)vWF、tPA、TFPI、TM的mRNA的表達(dá)均有一定的抑制作用;MRS可以促進(jìn)EA.hy926細(xì)胞中PAI、vWF、tPA、TMmRNA的表達(dá),而對(duì)PS和TFPI mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響;MRS-3可以促進(jìn)EA.hy926細(xì)胞中PAI、vWF、tPA、PS、TMmRNA的表達(dá),而對(duì)TFPI mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響。上述結(jié)果中只有PHL和MRS-1對(duì)EA.hy926細(xì)胞中凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響,MRS-1為對(duì)照組,所以接下來(lái)對(duì)PHL對(duì)內(nèi)皮功能紊亂的影響進(jìn)行探究。3.胃蛋白酶酶解水蛭提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的保護(hù)作用。我們首先以10 ng/mLTNF-α刺激EA.hy926細(xì)胞12 h建立內(nèi)皮功能紊亂的模型,經(jīng)過(guò) TNF-α 刺激后的 EA.hy926 細(xì)胞內(nèi) ET-1、iNOS、MCP-1 和 IL-6 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比均有明顯升高(#p0.05),而50μg/ml的PHL可以顯著抑制由TNF-α誘導(dǎo)的ET-1、iNOS、MCP-1和IL-6 mRNA的表達(dá)量的升高(*p0.05,**p0.01,***p0.001)。說(shuō)明PHL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂具有一定的保護(hù)作用。綜上所述,經(jīng)過(guò)胃蛋白酶酶解的水蛭提取物PHL對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中凝血相關(guān)因子PAI、vWF、tPA、PS、TFPI和TMmRNA的表達(dá)均無(wú)明顯影響,而且在50μg/ml濃度下對(duì)由TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂具有一定的保護(hù)作用。它為臨床上可長(zhǎng)期用于動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防,出血不良反應(yīng)弱的新型口服制劑的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：R285
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 緒論
    1 中藥水蛭概述
        1.1 水蛭的主要治療應(yīng)用
        1.2 水蛭的不良反應(yīng)
    2 機(jī)體凝血機(jī)制
        2.1 血小板
        2.2 凝血系統(tǒng)
        2.3 血管壁細(xì)胞
    3 動(dòng)脈粥樣硬化概述
        3.1 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程
        3.2 內(nèi)皮功能紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化
        3.3 目前治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物
    4 課題研究?jī)?nèi)容、意義
第二章 不同水蛭提取物對(duì)EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子的影響
    1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.4 主要試劑配方
        1.5 引物序列
    2 不同條件下水蛭提取物的制備
        2.1 水蛭粉水提物的制備
        2.2 胃蛋白酶酶解的水蛭提取物的制備
        2.3 胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶解的水蛭提取物的制備
        2.4 粗酶酶解的水蛭提取物的制備
        2.5 乳酸桿菌代謝轉(zhuǎn)化水蛭提取物的制備
        2.6 EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng)
        2.7 RT-PCR檢測(cè)不同水蛭提取物對(duì)EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子的影響
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 制備的結(jié)果以及菌種鑒定
        3.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)水蛭不同提取物對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響
        3.3 不同水蛭提取物對(duì)EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子的影響
    4 討論
    5 本章小結(jié)
第三章 PHL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂相關(guān)分子的影響
    1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.4 引物序列
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 內(nèi)皮功能紊亂模型的建立
        2.2 PHL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂相關(guān)分子的影響
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 內(nèi)皮功能紊亂模型的建立
        3.2 PHL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂相關(guān)分子的影響
    4 討論
    5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文
附表

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2879030