鎘是環(huán)境中常見的重金屬高毒性污染物,急慢性鎘暴露均能引起多種器官和組織的損傷。腎臟是鎘毒性作用的重要靶器官,鎘暴露時引起的氧化應(yīng)激和代謝紊亂均會導(dǎo)致腎臟損傷和細胞凋亡。葛根素是從中藥野葛根中提取的一種植物異黃酮,因其毒性低、代謝快且具有抗氧化、降血糖等作用,已在臨床上應(yīng)用于心血管疾病和糖尿病并發(fā)癥的治療。AMPK是機體能量代謝的感應(yīng)中心,缺血、缺氧或中毒時引起的機體代謝紊亂可激活A(yù)MPK/AKT信號通路,以此調(diào)節(jié)代謝平衡,保護機體免于進一步損傷。本文體內(nèi)和體外相結(jié)合,以大鼠和大鼠原代腎小管上皮細胞為模型,研究葛根素對鎘致腎臟損傷的保護效應(yīng)。1.鎘暴露致大鼠腎臟損傷及葛根素的保護效應(yīng)選用SD大鼠40只,隨機分為4組,對照組(無處理)、染毒組(CdAc2,2.5mg/kg·bw)、保護組(PU,200mg/kg·bw;CdAc2,2.5mg/kg·bw)、葛根素對照組(PU,200mg/kg·bw),處理周期為5周,其中PU每天灌胃,CdAc2在最后一周連續(xù)注射7d。實驗結(jié)束后,剖殺采集腎皮質(zhì)、全血、血清和尿液進行后續(xù)實驗。利用原子吸收光譜法測定大鼠腎皮質(zhì)、血清、尿液的鎘含量;血液常規(guī)分析儀測定大鼠血糖含量;可見光分光光度計測定大鼠血清丙二醛含量(MDA)、總超氧化物歧化酶活性(T-SOD)與總抗氧化能力(T-AOC);石蠟切片觀察腎臟病理變化;血液生化儀檢測血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(CREA)、尿β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和β2微球蛋白((β2-MG)含量;QRT-PCR檢測腎皮質(zhì)中自噬相關(guān)基因和AMPK通路相關(guān)基因的表達;Western blot檢測大鼠腎皮質(zhì)中凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白和AMPK通路相關(guān)蛋白的表達量。結(jié)果表明:①鎘在染毒組大鼠體內(nèi)的蓄積量極顯著高于對照組(P0.01),而保護組大鼠體內(nèi)的鎘蓄積量顯著低于染毒組(P0.01);②染毒組大鼠血清MDA含量顯著高于對照組(P0.01),T-SOD活性與T-AOC均低于對照組(P0.01),而保護組大鼠血清MDA含量顯著低于染毒組(P0.01),T-SOD活性和T-AOC均顯著高于染毒組(P0.01或P0.05);③染毒組大鼠血糖含量顯著高于對照組(P0.01),保護組大鼠血糖顯著低于染毒組(P0.05);④染毒組大鼠腎小管變性、腫脹、管腔狹窄,腎間質(zhì)大量紅細胞浸潤,腎小球充血,保護組大鼠病變減輕;⑤染毒組大鼠血清BUN和CREA含量均顯著高于對照組(P0.01),保護組大鼠血清BUN和CREA含量均顯著低于染毒組(P0.01);⑥染毒組大鼠尿液中NAG和β2-MG含量均顯著高于對照組(P0.01),保護組大鼠尿液中NAG含量顯著低于染毒組(P0.05),但β2-MG含量無明顯變化(P0.05);⑦染毒組大鼠腎皮質(zhì)Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 蛋白表達量顯著高于對照組(P0.01 或P0.05),Beclin1 表達量顯著低于對照組(P0.01),LC3II/LC3I、ATG5、p62、p-AMPK/AMPK表達量均無明顯變化(P0.05);保護組大鼠腎皮質(zhì)LC3II/LC3I、ATG5、Beclin1、p-AMPK/AMPK 表達量均顯著高于染毒組(P0.01 或P0.05),p62、Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達量顯著低于染毒組(P0.01或P0.05);⑧染毒組大鼠腎皮質(zhì)LC3、P62、BECN1、AKT、mTOR基因表達水平顯著高于對照組(P0.01或P0.05),ATG5、AMPK表達水平無明顯變化,保護組大鼠腎皮質(zhì)LC3、ATG5、BECN1、AMPK表達水平顯著高于染毒組(P0.01或P0.05),P62、AKT、mTOR基因表達水平顯著低于染毒組(P0.01 或 P0.05)。根據(jù)以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論:①鎘暴露可引起大鼠發(fā)生氧化損傷和代謝紊亂;②鎘暴露引起大鼠腎小管和腎小球損傷,并導(dǎo)致細胞凋亡;③葛根素可緩解鎘引起的氧化損傷,調(diào)節(jié)代謝平衡;④葛根素可通過AMPK/AKT信號通路調(diào)節(jié)自噬,拮抗鎘引起的細胞凋亡。2.鎘暴露致大鼠腎小管上皮細胞損傷及葛根素的保護效應(yīng)采用機械篩網(wǎng)結(jié)合酶消化法建立大鼠原代腎小管上皮細胞(rPT細胞)培養(yǎng)模型,在對數(shù)生長期時,將rPT細胞分為4組:對照組(無處理)、染毒組(10μMCdAc2)、保護組(50μMPU,1OμMCdAc2)、葛根素對照組(50μMPU);或?qū)φ战M(無處理)、染毒組(10μMCdAc2)、Cd+AICAR組(500OμMAICAR,1OμM CdAc2)、AICAR對照組(5000μMAICAR);或?qū)φ战M(無處理)、Cd+Dor組(50μMDor,1μM CdAc2)、Cd+PU+Dor組(50μM Dor,50μMPU,10μM CdAc2)、Dor對照組(50μMDor)。CCK-8法檢測各組rPT細胞活力,螢火蟲熒光素酶發(fā)光法檢測各組細胞內(nèi)ATP含量,DCFH-DA探針法檢測各組細胞內(nèi)ROS水平,透射電鏡觀察各組細胞超微結(jié)構(gòu),AnnexinV-FITC/PI進行雙染并使用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率,DAPI探針染色激光共聚焦技術(shù)檢測細胞核凋亡形態(tài)學(xué)變化,MDC探針染色激光共聚焦技術(shù)觀察細胞內(nèi)自噬囊泡數(shù)量,RFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染激光共聚焦技術(shù)觀察熒光聚點,GFP-RFP-LC3雙標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染激光共聚焦觀察細胞自噬流,Western blot檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白和AMPK通路相關(guān)蛋白的表達量。結(jié)果表明:①染毒組細胞活力和ATP水平顯著低于對照組(P0.01或P0.05),ROS水平顯著高于對照組(P0.01),保護組細胞活力和ATP水平顯著高于染毒組(P0.01或P0.05),ROS水平顯著低于染毒組(P0.01);②染毒組細胞中各細胞器受損、線粒體腫脹并出現(xiàn)不同程度的破損和空泡化,保護組細胞中出現(xiàn)自噬溶酶體,降解受損細胞器;③染毒組細胞凋亡率顯著高于對照組(P0.01),保護組細胞凋亡率顯著低于染毒組(P0.01);④染毒組細胞自噬體數(shù)量顯著多于對照組(P0.01或P0.05)但自噬流受阻,保護組細胞自噬體數(shù)量顯著多于染毒組(P0.05)且自噬流順暢;⑤染毒組細胞LC3II/LC3I、ATG5、Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達量顯著高于對照組(P0.01或P0.05),Beclin1表達量顯著低于對照組(P0.01),p-AMPK/AMPK、p62表達量均無明顯變化,保護組細胞LC3II/LC3I、ATG5、Beclin1、p-AMPK/AMPK表達量均顯著高于染毒組(P0.01 或P0.05),p62、Cleaved caspase-3、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達量顯著低于染毒組(P0.01或P0.05);⑥經(jīng)AMPK激動劑AICAR處理后,Cd+AICAR組細胞內(nèi)LC3II/LC3I、ATG5、Beclin1表達量均顯著高于Cd組(P0.01或P0.05),p62、Cleavedcaspase-3表達量均顯著低于對照組(P0.01或P0.05),單獨染Cd組細胞內(nèi)LC3Ⅱ/LC3I、ATG5、p62、Cleavedcaspase-3表達量均顯著高于對照組(P0.01或P0.05),Beclin1表達量顯著低于對照組(P0.01);⑦經(jīng)AMPK抑制劑Dor處理后,Cd+PU+Dor組細胞內(nèi)p-AKT/AKT表達量顯著高于Cd+PU組(P0.01),p-AMPK/AMPK表達量顯著顯著低于Cd+PU+Dor組(P0.05),p-mTOR/mTOR表達量無明顯變化;Cd+PU組細胞內(nèi)p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達量顯著高于對照組(P0.01或P0.05)。根據(jù)以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論:①鎘可引起rPT細胞活力下降、形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的損傷、氧化損傷和代謝異常;②鎘可引起rPT細胞自噬流受阻,并導(dǎo)致細胞凋亡;③葛根素可緩解鎘引起的rPT細胞損傷,維持代謝平衡;④葛根素可通過激活A(yù)MPK通路調(diào)節(jié)自噬,拮抗鎘引起的rPT細胞凋亡。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

?ｓｅｒｕｍ?ｕｒｉｎｅ??圖２－１處理結(jié)束時大鼠腎皮質(zhì)、血清及尿液中的鎘含量??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｍｅｔａｌ?ｌｅｖｅｌｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｕｒｉｎｅ，?ｓｅｒｕｍ?ａｎｄ?ｒｅｎａｌ?ｃｏｒｔｅｘｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｒａｔｓ?ａｔ?ｔｈｅ?ｅｎｄ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ??（ｎｓ?尸＞０．０５，＊＊?尸＜０．０１）??３．１．２葛根素緩解鎘導(dǎo)致的大鼠生長緩慢與血糖升高??通過每天記錄各組大鼠體重變化（圖２－２－１），前四周各組大鼠體重均勻增長且漲幅無??明顯變化，但在第五周染毒時，染毒組大鼠與其余三組大鼠相比，體重漲幅減緩但無顯著??差異（Ｐ＞０．０５）；??５?令?Ｃｏｎｔ??＋?Ｃｄ??一?５００－?士?Ｃｄ＋ＰＵ??�。海海�?＾ｐｕ??１３５〇－??３００?１?Ｉ?１?Ｉ?１???Ｗ１?Ｗ２?Ｗ３?Ｗ４?Ｗ５??圖２－２－１鎘對大鼠體重變化的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２－１?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃａｄｍｉｕｍ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｂｏｄｙ?ｗｅｉｇｈｔ?ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ｒａｔｓ??所測各組大鼠血糖含量見圖２－２－２，對照組與葛根素組大鼠血糖無明顯變化（Ｐ＞０．０５），??但鎘組大鼠血糖升高為對照組大鼠的１．５倍，而保護組大鼠血糖含量則降為鎘組大鼠的０．８??倍。說明鎘暴露能引起大鼠血糖顯著升高（戶＜〇．〇１）

３．１．３葛根素通過提高抗氧化能力緩解鎘導(dǎo)致的機體氧化損傷??所測各組大鼠血清丙二醛（ＭＤＡ）含量、總超氧化物歧化酶（Ｔ－ＳＯＤ）活性與總抗氧??化能力（Ｔ－ＡＯＣ）見圖２－３，對照組與葛根素組大鼠血清ＭＤＡ含量、Ｔ－ＳＯＤ活性與Ｔ－ＡＯＣ??均無明顯變化（Ｐ＞〇．〇５），但染毒組大鼠血清ＭＤＡ含量升高為為對照組的１．３倍，Ｔ－ＳＯＤ??活性與Ｔ－ＡＯＣ分別降低為對照組的０．８倍和０．５倍；而保護組大鼠血清ＭＤＡ、Ｔ－ＳＯＤ與??Ｔ－ＡＯＣ分別為染毒組的０．６倍、１．１倍和１．５倍。說明鎘暴露能造成大鼠機體脂質(zhì)過氧化水??平顯著升高（ＰｃＯ．Ｏｌ），抗氧化能力顯著降低（戶＜〇．〇１），而葛根素能夠顯著）緩解鎘導(dǎo)致??的大鼠機體氧化損傷并顯著提高其抗氧化能力（Ｐ＜０．０１?）。??？ｋｉｅ?＊??ｉ?”?＊＊?＊＊?ｐ＾ｎｎ?■???ＩＩＪ?Ｔ?＿?Ｒｊ??＾?ｎｓ?Ｉ?ｍｍ?Ｉｍ?Ｍ?Ｃｄ??８４？門?ｉ?＊＊?＊＊?■圍?Ｑ，?Ｃｄ＋ＰＵ??［ｌｌｌＪ?Ｓｒ?１１１??ＭＤＡ?ＳＯＤ?ＡＯＣ??圖２－３鎘和葛根素對大鼠機體抗氧化能力的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃａｄｍｉｕｍ?ａｎｄ?ｐｕｅｒａｒｉｎ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｂｏｄｙ＇ｓ?ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ?ｃａｐａｃｉｔｙ?ｏｆ?ｒａｔｓ??（ｎｓＰ＞０．０５，?＊Ｐ＜０．０５，?＊＊Ｐ＜０．０１）??

§?〇?，?，???Ｉ?Ｃｏｍ?ＰＵ?Ｃｄ?Ｃｄ＋ＰＵ??圖２－２－２鎘和葛根素對大鼠血糖水平的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２－２?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃａｄｍｉｕｍ?ａｎｄ?ｐｕｅｒａｒｉｎ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｂｌｏｏｄ?ｇｌｕｃｏｓｅ?ｌｅｖｅｌｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??（ｎｓ?Ｐ＞０．０５，?＊Ｐ＜０．０５，?＊＊?戶＜０．０１）??葛根素通過提高抗氧化能力緩解鎘導(dǎo)致的機體氧化損傷??測各組大鼠血清丙二醛（ＭＤＡ）含量、總超氧化物歧化酶（Ｔ－ＳＯＤ）活性與總抗氧??（Ｔ－ＡＯＣ）見圖２－３，對照組與葛根素組大鼠血清ＭＤＡ含量、Ｔ－ＳＯＤ活性與Ｔ－ＡＯＣ??顯變化（Ｐ＞〇．〇５），但染毒組大鼠血清ＭＤＡ含量升高為為對照組的１．３倍，Ｔ－ＳＯＤ??Ｔ－ＡＯＣ分別降低為對照組的０．８倍和０．５倍；而保護組大鼠血清ＭＤＡ、Ｔ－ＳＯＤ與??Ｃ分別為染毒組的０．６倍、１．１倍和１．５倍。說明鎘暴露能造成大鼠機體脂質(zhì)過氧化水??升高（ＰｃＯ．Ｏｌ），抗氧化能力顯著降低（戶＜〇．〇１），而葛根素能夠顯著）緩解鎘導(dǎo)致??鼠機體氧化損傷并顯著提高其抗氧化能力（Ｐ＜０．０１?）。??？ｋｉｅ?＊??
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本文編號：2876204