【研究背景】骨肉瘤是兒童和青少年最常見的骨組織惡性腫瘤之一,惡性程度高,侵襲性強,易早期發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。雖然手術(shù)和新輔助化療的應用大大提高了患者的生存率,但仍有近一半患者死于轉(zhuǎn)移。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學特征,也是惡性腫瘤患者的主要死因。所以如何有效預防和治療轉(zhuǎn)移,對改善骨肉瘤患者的預后至關(guān)重要。槲皮素(Quercetin)是一類天然類黃酮物質(zhì),廣泛存在于蔬菜、水果和植物中,具有多種生物學功能。大量研究報道槲皮素具有抗炎、抗過敏、擴張冠脈、抗血小板聚集、抗氧化、抗癌防癌、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。在歐美等國家,槲皮素已經(jīng)被推薦為天然的潛力抗癌藥物。新近研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠降低乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生。然而,槲皮素在骨肉瘤中的研究鮮見報道�！狙芯磕康摹客ㄟ^體內(nèi)外實驗觀察槲皮素對人骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用和相關(guān)分子機制,為更好地理解槲皮素的潛在抗骨肉瘤作用提供理論基礎(chǔ)�！狙芯糠椒ā�1.槲皮素對骨肉瘤細胞活力、周期、凋亡的影響(1)人骨肉瘤細胞株HOS和人骨肉瘤細胞株MG63,復蘇傳代培養(yǎng)。向24孔板中加入5×10~4個細胞/孔,采用不同濃度組槲皮素(0、25、50、100μM)作用12h和24h后,再向每孔細胞中加入40μl CCK-8試劑,37°C生化培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h,然后在450nm波長處測定細胞吸光度值來檢測細胞活力。(2)向24孔板中加入5×10~4個細胞/孔,采用不同濃度組槲皮素(0、25、50、100μM)作用24h后,胰酶消化細胞,根據(jù)細胞周期試劑盒說明書測定人骨肉瘤細胞的細胞周期變化。(3)用FITC/PI試劑盒測定細胞的凋亡情況。向24孔板中加入5×10~4個細胞/孔,采用不同濃度組槲皮素(0、25、50、100μM)作用24h后,根據(jù)FITC/PI凋亡試劑盒說明書測定人骨肉瘤細胞的細胞凋亡情況。2.槲皮素對骨肉瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響(1)將50μl液化的Matrigel基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室的微孔膜上,于37℃孵育6h,使Matrigel聚合成膠。細胞鋪板6小時后,加入不同濃度組的槲皮素(0、25、50、100μM)處理。以不含血清的培養(yǎng)基重懸骨肉瘤細胞,加入5×10~4個細胞/孔在transwell上室,下室加入含10%血清培養(yǎng)基,作用24h,固定細胞,結(jié)晶紫染色后用棉簽輕輕拭去基質(zhì)膠和上室細胞,200×光鏡下觀察5個視野并計數(shù)穿過人工基底膜的細胞數(shù),計算其平均值。(2)收集對數(shù)生長期的骨肉瘤細胞,接種于24孔板中(5×10~4個細胞/孔)。細胞培養(yǎng)24h,長滿單層后,用10μl槍頭比著直尺,盡量垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗去劃痕后漂浮的細胞(以此作為0 h),加入不同濃度組槲皮素(0、25、50、100μM)的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),檢測細胞的遷移率。在0h,12h和24h時于光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。3.槲皮素對骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因mRNA和蛋白變化的影響(1)實時熒光定量PCR法測定HIF-1α,VEGF,MMP2和MMP9 mRNA表達情況:向6孔板中加入2×10~5個細胞/孔,加入不同濃度組槲皮素(0、25、50、100μM)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)到時間點的細胞棄培養(yǎng)基,Trizol法提取骨肉瘤細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應根據(jù)TAKARA公司RT試劑盒進行,熒光定量PCR反應是根據(jù)TAKARA公司熒光定量PCR試劑盒說明書建立。反應產(chǎn)物的特異性通過溶解曲線為單峰來判斷。(2)用蛋白免疫印跡實驗(Western blotting)測定HIF-1α,VEGF,MMP2和MMP9蛋白表達情況:向6孔板中加入2×10~5個細胞/孔,加入不同濃度組槲皮素(0、25、50、100μM)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)到時間點的細胞棄培養(yǎng)基,將含蛋白酶抑制劑的RIPA加入骨肉瘤細胞中,刮取并離心細胞,收集細胞裂解上清液。取40μg蛋白上樣,采用SDS-PAGE法電泳,分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1h,4℃孵育HIF-1α,VEGF,MMP2和MMP9的多克隆抗體過夜,室溫孵育二抗1h,加入ECL曝光。用ImageJ圖像分析軟件分析免疫印跡灰度值。4.裸鼠成瘤動物實驗(1)實驗分組:(1)空白對照組:生理鹽水;(2)陽性對照組:順鉑組,2mg/kg;(3)槲皮素組:a.低濃度組,25mg/kg;b.中濃度組:50mg/kg;c.高濃度組:100mg/kg。(2)細胞準備和藥物準備:構(gòu)建重組質(zhì)粒p Lenti-CMV-mCherry-linker-Luc-PGK轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒,感染人骨肉瘤細胞HOS,熒光鑒定感染率100%,建立穩(wěn)定細胞株。取對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化離心后,用生理鹽水重懸,配制成5×10~8個/ml單細胞懸液。(3)模型建立及給藥方案:30只裸鼠隨機分為五組。在無菌條件下于裸鼠尾靜脈接種,每只裸鼠接種0.2ml(即1×10~8個細胞)單細胞懸液。3天后,腹腔注射25,50或100 mg/kg槲皮素。每日兩次,為期四周。陽性對照組順鉑劑量為2mg/kg。陰性對照組用生理鹽水注射。四周后裸鼠采用水合氯醛麻醉,腹腔注射D-熒光素30秒后頸椎脫臼處死,手術(shù)去除前胸壁,馬上用活體小動物成像系統(tǒng)和活體圖像軟件檢測肺轉(zhuǎn)移灶。所有的上述程序和化驗方法經(jīng)廣州醫(yī)科大學動物衛(wèi)生管理和使用委員會批準。計算抑制率:[(C-T)/C]×100%(公式1),治療組的平均熒光為T,C為陰性對照組的平均熒光�！緦嶒灲Y(jié)果】1、槲皮素對人骨肉瘤細胞活力的影響:0、25、50、100μM的槲皮素作用于人骨肉瘤細胞株HOS和人骨肉瘤細胞株MG63 12h和24h,CCK-8法檢測細胞活性。結(jié)果顯示,不同濃度的槲皮素對人骨肉瘤細胞HOS和MG63活性無明顯影響,P0.05,無統(tǒng)計學意義。根據(jù)CCK-8測定槲皮素對人骨肉瘤細胞活力影響的結(jié)果,可選取0、25、50、100μM可作為后續(xù)實驗刺激濃度。2、槲皮素對人骨肉瘤細胞周期的影響:不同濃度槲皮素(0、25、50、100μM)刺激人骨肉瘤細胞株HOS和MG6324h,應用細胞周期檢測試劑盒測定細胞周期分布狀況。結(jié)果顯示,不同濃度槲皮素(0、25、50、100μM)對人骨肉瘤細胞株HOS和MG63細胞G_0/G_1、G_2/M和S期無明顯影響,其差異沒有統(tǒng)計學意義。3、槲皮素對人骨肉瘤細胞凋亡的影響:不同濃度槲皮素(0、25、50、100μM)刺激人骨肉瘤細胞株HOS和MG6324 h,應用Alexa Fluor 488 annexin V/Dead cell凋亡試劑盒測定凋亡情況。與0μM槲皮素對照組比較,槲皮素刺激下人骨肉瘤細胞HOS和MG63未發(fā)生明顯的早期或者中晚期凋亡。4、槲皮素對人骨肉瘤細胞侵襲能力的影響:采用Transwell侵襲小室實驗觀察槲皮素作用后人骨肉瘤細胞侵襲通過人工基底膜后的能力。下室加入含不同濃度槲皮素的含血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24小時。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,25μM槲皮素組、50μM槲皮素組、100μM槲皮素組平均穿膜HOS細胞數(shù)分別為0μM槲皮素組平均穿膜細胞數(shù)的(83.98±2.76)%,(38.67±3.52)%和(16.36±2.56)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),槲皮素處理組穿膜HOS細胞數(shù)明顯低于0μM槲皮素空白對照組。隨著槲皮素濃度增加,抑制HOS細胞侵襲能力增加。25μM槲皮素組、50μM槲皮素組、100μM槲皮素組平均穿膜MG63細胞數(shù)分別為0μM槲皮素組平均穿膜細胞數(shù)的(87.55±4.98)%,(69.34±5)%和(41.98±4.4)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),槲皮素處理組穿膜MG63細胞數(shù)明顯低于0μM槲皮素空白對照組。隨著槲皮素濃度增加,抑制MG63細胞侵襲能力增加。我們研究證實了,槲皮素抑制人骨肉瘤細胞的細胞侵襲,呈劑量依賴。5、槲皮素對人骨肉瘤細胞遷移能力的影響:我們采用劃痕實驗來觀察槲皮素對人骨肉瘤細胞的遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同濃度的槲皮素作用于兩種人骨肉瘤細胞。處理12h后,25μM槲皮素組、50μM槲皮素組、100μM槲皮素組與0μM槲皮素組對照組遷移距離的比率分別為:HOS細胞(72.28±22.34)%、(61.49±19.61)%、(49.66±9.33)%;MG63細胞(39.49±5.9)%、(31.15±12.27)%、(20.34±4.25)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。處理24h后,25μM槲皮素組、50μM槲皮素組、100μM槲皮素組與0μM槲皮素組對照組遷移距離的比率分別為:HOS細胞(59.40%±20.13)%、(42.78±11.34)%、(46.06±11.5)%;MG63細胞(36.39±3.09)%、(28.43±0.7)%、(21.26±7.47)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。我們研究證實,槲皮素能夠抑制人骨肉瘤細胞的細胞遷移,呈劑量時間依賴。6、槲皮素對人骨肉瘤細胞相關(guān)基因mRNA和蛋白的影響:不同濃度槲皮素(0、25、50、100μM)刺激人骨肉瘤細胞株HOS 24 h,提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR。結(jié)果顯示,隨著槲皮素濃度增加,HIF-1α(0.65±0.05,0.08±0.02,0.04±0.01);VEGF(0.25±0.09,0.07±0.01,0.01±0.01);MMP2(0.48±0.06,0.15±0.05,0.14±0.07);MMP9(0.28±0.08,0.12±0.02,0.08±0.02)的mRNA水平呈現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象,與0μM槲皮素對照組相比,有統(tǒng)計學意義,P0.05。蛋白免疫印跡結(jié)果所示,0、25、50、100μM槲皮素處理后HIF-1α的灰度值分別為:(0.57±0.08,0.45±0.07,0.42±0.08,0.42±0.01);VEGF的灰度值分別為(0.51±0.04,0.48±0.09,0.37±0.10,0.25±0.03);MMP2的灰度值分別為(0.59±0.01,0.54±0.13,0.46±0.07,0.34±0.01);MMP9的灰度值分別為(1.07±0.06,0.89±0.19,0.75±0.07,0.60±0.16)。隨著槲皮素濃度增加,HIF-1α、VEGF、MMP 2、MMP 9的蛋白水平呈現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象,與0μM槲皮素對照組相比,有統(tǒng)計學意義,P0.05。槲皮素抑制人骨肉瘤細胞的HIF-1α、VEGF、MMP 2和MMP 9的mRNA和蛋白表達,呈劑量依賴。7、裸鼠成瘤動物實驗:為明確槲皮素對骨肉瘤的影響,體內(nèi)注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HOS細胞入裸鼠尾靜脈。術(shù)后三天,動物予槲皮素、生理鹽水或順鉑治療等效體積。實驗結(jié)果表明槲皮素能劑量依賴性顯著抑制肺部腫瘤生長。與生理鹽水治療的對照鼠對比,25、50和100 mg/kg槲皮素處理鼠的肺腫瘤熒光表達分別為0.89±0.10,0.71±0.06,0.63±0.05,順鉑治療組鼠腫瘤為0.63±0.04。根據(jù)公式1計算抑瘤率,與生理鹽水處理組對比,100 mg/kg槲皮素槲皮素抑制腫瘤37.41%、順鉑治療抑制腫瘤36.46%。結(jié)果表明,槲皮素能抑制骨肉瘤體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移�！緦嶒灲Y(jié)論】1、25-100μM槲皮素不影響人骨肉瘤細胞的細胞活性,不影響人骨肉瘤細胞的凋亡和周期改變。2、槲皮素抑制人骨肉瘤細胞的細胞侵襲轉(zhuǎn)移,呈劑量依賴。3、槲皮素抑制人骨肉瘤細胞的HIF-1α、VEGF、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表達,呈劑量依賴。4、裸鼠成瘤動物實驗,進一步證實了槲皮素可抑制裸鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤生成。
【學位單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

結(jié) 果結(jié) 果1. 槲皮素對人骨肉瘤細胞活力的影響以濃度為 0、25、50、100μM 的槲皮素作 用于人骨肉瘤細胞株 HOS 和人骨肉瘤細胞株 MG63 12h 和 24h，CCK-8 法檢測細胞活性。圖 1 顯示，不同濃度的槲皮素對人骨肉瘤細胞 HOS 和 MG63 活性無明顯影響，P>0.05，無統(tǒng)計學意義。根據(jù) CCK-8 測定槲皮素對人骨肉瘤細胞活力影響的結(jié)果，選取 0、25、50、100μM 可作為后續(xù)實驗刺激濃度。

圖 2 槲皮素對人骨肉瘤細胞周期的影響A：不同濃度槲皮素刺激 HOS 細胞 24h 周期細胞各期比例圖； B：不同濃度槲皮素刺激MG63 細胞 24h 周期細胞各期比例圖； C：不同濃度槲皮素刺激 HOS 細胞 24h 周期細胞各期比例統(tǒng)計圖； D：不同濃度槲皮素刺激 MG63 細胞 24h 周期細胞各期比例統(tǒng)計圖。數(shù)據(jù)以 mean ± SD 表示。表 1 槲皮素對人骨肉瘤細胞 HOS 和 MG63 細胞周期的影響HOS MG63G0/G1(%) S(%) G2/M(%) G0/G1(%) S(%) G2/M(%)0μM 31.31±0.83 30.16±0.73 27.88±0.73 19.88±2.47 56.02±1.51 14.80±1.1025μM 31.23±0.23 27.68±1.78 26.71±3.35 22.81±2.19 53.54±2.69 13.34±0.3550μM 31.96±2.06 27.23±1.78 29.24±2.13 22.56±1.19 55.04±1.10 13.14±1.26100μM 30.40±2.36 27.97±2.88 28.27±2.19 19.49±2.21 55.98±1.36 15.42±1.19

3. 槲皮素對人骨肉瘤細胞凋亡的影響不同濃度槲皮素（0、25、50、100μM）刺激人骨肉瘤細胞株 HOS 和 MG6324h，應用 Alexa Fluor 488 annexin V/Dead cell 凋亡試劑盒測定凋亡情況。槲皮素刺激人骨肉瘤細胞 HOS，凋亡細胞占百分比為 0μM 槲皮素對照組（1.47±0.18）%、25μM 槲皮素對照組（1.50±0.18）%、50μM 槲皮素對照組刺激組（1.50±0.26）%，100μM 槲皮素對照組刺激組（1.51±0.05）%（圖 3A）。與 0μM 槲皮素對照組比較，槲皮素刺激下人骨肉瘤細胞 HOS 未發(fā)生明顯的早期或者中晚期凋亡（圖 3C）。槲皮素刺激人骨肉瘤細胞 MG63，凋亡細胞占百分比為 0μM槲皮素對照組（4.32±1.56）%、25μM 槲皮素對照組（4.56±0.33）%、50μM槲皮素對照組刺激組（4.66±0.45）%、100μM 槲皮素對照組刺激組（4.62±1.71）%（圖 3B）。與 0μM 槲皮素對照組比較，槲皮素刺激下人骨肉瘤細胞 MG63 未發(fā)生明顯的早期或者中晚期凋亡（圖 3D）。
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本文編號：2873180