目的:探討丹防膠囊對(duì)大鼠免疫性肝纖維化肝組織Wnt1、β-catenin、DKK1表達(dá)的影響。方法:60只清潔級(jí)雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法平均分為6組:模型組、丹低組、丹中組、丹高組、陽(yáng)性對(duì)照組、正常組,每組10只。正常組腹腔注射等量生理鹽水,除正常組外各組腹腔注射0.5 mL/只豬血清制備大鼠免疫性肝纖維化模型,每周2次,共12周。造模同時(shí),丹低組、丹中組、丹高組分別予丹防膠囊(0.054 g/100g、0.216 g/100g、0.432 g/100g)灌胃,陽(yáng)性對(duì)照組予0.054 g/100g復(fù)方鱉甲軟肝片灌胃,模型組與正常組予等量生理鹽水灌胃,1次/d,共12周。第12周麻醉處死大鼠,行HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變,堿水解法檢測(cè)肝組織羥脯氨酸(HYP)含量,免疫組織化學(xué)法、Western Blot、Q-PCR檢測(cè)肝組織Wnt1、β-catenin、DKK1表達(dá)水平。結(jié)果:1.動(dòng)物一般情況:整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠一般狀態(tài)良好,毛發(fā)光澤。實(shí)驗(yàn)第1周,因灌胃操作失誤,丹低組和丹中組各死亡一只;實(shí)驗(yàn)第5周,模型組一只大鼠因肺部有出血灶死亡,剩余組別未出現(xiàn)大鼠死亡現(xiàn)象。2.肝組織病理學(xué)改變:模型組大鼠肝纖維化最嚴(yán)重,出現(xiàn)肝組織實(shí)質(zhì)廣泛被破壞,肝細(xì)胞排列紊亂形成條索狀向肝小葉延伸,分割并破壞肝小葉結(jié)構(gòu),甚至出現(xiàn)假小葉,提示造模成功。與正常組相比,模型組、丹低組及丹中組肝纖維化程度嚴(yán)重(F=53.55、42.95、39.45,均P0.05);與模型組相比,丹中組、丹高組肝纖維化減輕(F=39.45、18.80,均P0.05);丹低組與丹中組纖維化程度重于陽(yáng)性對(duì)照組(F=42.95、39.45,均P0.05),而丹高組與陽(yáng)性對(duì)照組相類似,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);丹防膠囊各劑量組比較,丹低組、丹中組及丹高組肝纖維化程度依次減輕,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。3.肝組織HYP含量:與正常組相比,模型組及丹低組HYP含量增多(t=-144.565、-28.806,均P0.05);與模型組相比,丹中組、丹高組HYP含量降低(t=92.253、165.217,均P0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組相比,丹低組及丹中組HYP含量上升(t=8.621、-6.874,P0.05),丹高組與其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);低組、丹中組及丹高組HYP含量依次減輕,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。4.肝組織免疫組化、western blot及Q-PCR結(jié)果:與正常組比較,模型組、丹低組及丹中組Wnt1、β-catenin表達(dá)增加(P0.05),DKK1表達(dá)下降(P0.05);與模型組比較,丹中組、丹高組Wnt1、β-catenin表達(dá)降低(P0.05),DKK1表達(dá)增高(P0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組相比,丹低組及丹中組Wnt1、β-catenin表達(dá)增多(P0.05),DKK1表達(dá)減少(P0.05),丹高組與陽(yáng)性對(duì)照組間Wnt1、β-catenin、DKK1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);低組、丹中組及丹高組Wnt1、β-catenin基因及蛋白表達(dá)依次下降,DKK1基因及蛋白表達(dá)依次增高,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。結(jié)論:1.中、高劑量丹防膠囊對(duì)大鼠免疫性肝纖維化有干預(yù)作用,不同劑量丹防膠囊間存在量效關(guān)系,以高劑量組效果更佳;2.丹防膠囊可能通過(guò)上調(diào)肝組織DKK1表達(dá),減少Wnt1、β-catenin表達(dá),抑制Wnt/β-catenin通路的激活,從而發(fā)揮對(duì)大鼠免疫性肝纖維化的干預(yù)作用。
【學(xué)位單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

GAPDHF:TTCCAGTATGACTCTACCCAC128R:TCACCCCATTTGATGTTAGCG1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料采用mean± X 表示，連續(xù)型變量服從正態(tài)分布。比較多組結(jié)果采用單因素方差分析齊性方差時(shí)，兩組間采用 LSD 檢驗(yàn)；非齊性方差采用 Tamhane T2 分析；各組間肝纖維化分期結(jié)果比較采用 K-W 檢驗(yàn)；P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 各組大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠一般狀態(tài)良好，正常飲食，毛發(fā)光澤。實(shí)驗(yàn)第 1 周因灌胃操作失誤，丹低組與丹中組各死亡 1 只；第 5 周模型組因肺部出現(xiàn)出血灶致 1 只大鼠死亡，剩余各組大鼠未出現(xiàn)死亡情況。2.2 肝組織病理學(xué)改變 正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞呈放射狀排列且相互間連接形成肝細(xì)胞條索，肝小葉及匯管區(qū)未見(jiàn)膠原纖維增生。與正常組相比，模型組可見(jiàn)廣泛肝組織破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，匯管區(qū)可見(jiàn)

免疫組化檢測(cè) Wnt1 定位于細(xì)胞質(zhì)，肝組織正常時(shí)有少量表達(dá)甚至不表常組相比，模型組、丹低組和丹中組 Wnt1 表達(dá)增加（t= -35.967、-11.91，均 P＜0.05）；與模型組相比，丹低組 Wnt1 蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.05），丹中組及丹高組 Wnt1 表達(dá)下降（t=30.465、43.950，均 P＜0.05性對(duì)照組相比，丹低組和丹中組 Wnt1 表達(dá)升高（t=-3.190、-0.641，均5），丹高組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；丹低組、丹中組 Wnt1 蛋白表達(dá)依次下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）2-4-1。 免疫組化法檢測(cè)各組大鼠肝組織 Wnt1、β-catenin、DKK1 蛋白的表達(dá)

圖 2-4-2 肝組織β-catenin 蛋白表達(dá)（免疫組化，×400）Fig.2-4-2 Expression of β-catenin protein (immunohistochemistry, ×40免疫組化檢測(cè) DKK1 定位于細(xì)胞核，正常肝組織中大量表達(dá)。比正常組模型組、丹低組和丹中組 DKK1 表達(dá)下降（t=5.037、3.956、3.047，均5）；與模型組相比，丹低組 DKK1 蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），及丹高組 DKK1 表達(dá)增高（t= -2.896、-5.333，均 P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)，丹低組和丹中組 DKK1 蛋白表達(dá)下降（t=3.503、1.894，均 P＜0.05）組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；丹低組、丹中組及丹高組 D表達(dá)依次增高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），如圖 2-4-3 Wnt1、β-catenin、DKK1 蛋白相對(duì)表達(dá)量如圖 2-4-4。
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