目的:在體與離體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,探索甘參復(fù)方對(duì)膽汁淤積型肝纖維化大鼠肝纖維化程度的影響。同時(shí),通過觀察甘參復(fù)方對(duì)肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)活化程度、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinases,p-ERK)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)表達(dá)的影響,揭示甘參復(fù)方抗肝纖維化的機(jī)制。方法:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、甘參復(fù)方組,采用膽總管結(jié)扎法(bile duct ligation,BDL)制備膽汁性肝纖維化大鼠模型,在2周、4周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材。甘參復(fù)方組按前期實(shí)驗(yàn)確定給藥劑量(25mg·kg~(-1))。通過HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化,Masson染色觀察肝臟纖維組織再生情況,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)檢測(cè)肝組織腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)表達(dá),免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)肝組織內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ,Col.Ⅰ)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平的變化。2.體外實(shí)驗(yàn):離體培養(yǎng)永生化大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6(表現(xiàn)為活化型),觀察甘參復(fù)方對(duì)HSC-T6活化的影響及其機(jī)制:(1)將甘參復(fù)方稀釋成6個(gè)不同的濃度梯度,采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況,篩選出甘參復(fù)方對(duì)HSC-T6的最佳作用濃度。(2)將細(xì)胞分為正常對(duì)照組,甘參復(fù)方低、中、高濃度組,采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中的Col.I含量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證甘參復(fù)方對(duì)HSC-T6的活化影響,應(yīng)用2ng·ml~(-1)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激HSC-T6,將細(xì)胞分為5組,即正常對(duì)照組、TGF-β1組和TGF-β1+甘參復(fù)方低、中、高濃度組,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)甘參復(fù)方對(duì)HSC-T6增殖的影響。用用免疫熒光法檢測(cè)HSC-T6中的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá);Western Blot法檢測(cè)各組HSC-T6中p-ERK和NF-κB的表達(dá)。并且用ERK抑制劑PD98059和激動(dòng)劑血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)作用于HSC-T6,從不同角度觀察甘參復(fù)方對(duì)p-ERK表達(dá)的影響。結(jié)果:1.甘參復(fù)方顯著抑制膽汁性肝纖維化大鼠肝組織的纖維組織生成:(1)HE染色顯示,膽總管結(jié)扎2周后,肝細(xì)胞變性壞死,膽小管顯著增生,門管區(qū)伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤。4周后,肝細(xì)胞廣泛變性壞死,膽小管增生更加顯著,門管區(qū)周圍和壞死區(qū)域大量纖維組織增生。增生的纖維組織相互連接,形成“假小葉”。甘參復(fù)方能夠在2周、4周明顯抑制肝組織纖維增生,緩解肝臟結(jié)構(gòu)紊亂以及炎癥細(xì)胞浸潤。(2)Masson染色顯示,假手術(shù)組大鼠,僅在肝中央靜脈和匯管區(qū)周圍有少量纖維組織。膽總管結(jié)扎2周后,纖維組織顯著增生。膽總管結(jié)扎4周后,增生的纖維組織相互連接,形成“假小葉”。甘參復(fù)方在2周和4周可以顯著抑制纖維組織再生。(3)ELISA結(jié)果顯示,膽總管結(jié)扎2周和4周以后,肝組織TNF-α和IL-1β含量顯著增加,與假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01,P0.001)。與模型組比較,甘參復(fù)方組肝組織TNF-α和IL-1β合成減少,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。(4)Western blot結(jié)果顯示,2周和4周以后,模型組肝組織Col.Ⅰ和P-ERK合成顯著增加,與假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。甘參復(fù)方在2周和4周能夠顯著抑制Col.Ⅰ和p-ERK合成,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。2.甘參復(fù)方可抑制HSC-T6活化以及ERK通路的磷酸化:(1)甘參復(fù)方作用24h后,0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μmol·L~(-1)6個(gè)濃度藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用,與正常對(duì)照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。于此基礎(chǔ)上篩選甘參復(fù)方低(0.125μmol·L~(-1))、中(0.25μmol·L~(-1))、高(0.5μmol·L~(-1))三個(gè)濃度組。(2)ELISA結(jié)果顯示,0.125、0.25、0.5μmol·L~(-1)的甘參復(fù)方能夠抑制HSC-T6分泌Col.Ⅰ,其中0.5μmol·L~(-1)與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)TGF-β1顯著誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞增殖,與正常對(duì)照組相比,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),甘參復(fù)方中、高濃度能明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(P0.05)。(4)經(jīng)TGF-β1刺激后的細(xì)胞上清Col.Ⅰ含量以及胞內(nèi)α-SMA生成顯著增加,與對(duì)照組比較,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。與TGF-β1組對(duì)比,3個(gè)濃度甘參復(fù)方均能減少膠原合成和α-SMA生成(P0.05,P0.01)。(5)甘參復(fù)方對(duì)活化肝星狀細(xì)胞NF-κB/ERK信號(hào)通路活化有下調(diào)作用:與正常對(duì)照組比較,甘參復(fù)方低、中、高濃度組的細(xì)胞磷酸化ERK和NF-κB表達(dá)均顯著減少,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,P0.01,P0.001)。PDGF-BB刺激后細(xì)胞p-ERK蛋白的表達(dá)升高(P0.05),PD98059可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ERK磷酸化。低、中、高3個(gè)濃度甘參復(fù)方組均可下調(diào)PDGF-BB誘導(dǎo)的ERK磷酸化,與PDGF-BB刺激組比較,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論:1.甘參復(fù)方能夠改善肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu),抑制膠原纖維增生,減輕肝臟炎癥反應(yīng),從而達(dá)到抗纖維化作用,其機(jī)制可能是通過抑制ERK磷酸化,從而抑制HSC增殖。2.甘參復(fù)方能夠抑制HSC-T6增殖、α-SMA和Col.Ⅰ的表達(dá),提示甘參復(fù)方抗纖維化的內(nèi)在機(jī)制之一可能是抑制肝星狀細(xì)胞的活化。3.甘參復(fù)方能夠抑制NF-κB的表達(dá),且能夠下調(diào)HSC-T6中ERK磷酸化水平,提示甘參復(fù)方通過抑制NF-κB表達(dá),從而抑制炎癥反應(yīng)以及由炎癥激活的ERK通路,繼而抑制HSC活化和增殖。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

肝組織大體觀察

如圖2所示,假手術(shù)組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞圍繞居中的中央靜脈向四周呈放射狀排列,肝小葉周圍的匯管區(qū)僅見少量成纖維細(xì)胞(見圖2-A)。膽總管結(jié)扎2周,模型組肝組織可見肝小葉之間界限不明顯,肝索排列疏松紊亂,匯管區(qū)周圍成纖維細(xì)胞增多,間質(zhì)有少量淋巴細(xì)胞浸潤,膽管上皮細(xì)胞及小膽管增生,增生的纖維組織延伸至肝小葉內(nèi),部分肝細(xì)胞被增生的纖維包繞,肝竇增寬(見圖2-B)。甘參復(fù)方組(2周)顯示,與模型組比較,肝小葉破壞、膽小管增生以及纖維增生等肝組織損害程度均有所改善(見圖2-C)。造模4周后,模型組肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,大量炎癥細(xì)胞浸潤,伴隨彌漫性的膽小管增生。同時(shí),增生的纖維組織深入肝小葉內(nèi),并分割肝小葉,形成大量“假小葉”(見圖2-D)。甘參復(fù)方組(4周)可見肝組織結(jié)構(gòu)、膠原纖維增生范圍較模型組明顯減輕,仍可見部分炎癥細(xì)胞浸潤(見圖2-E)。1.3 各組大鼠肝組織Masson染色結(jié)果

如圖3所示,肝臟中的膠原纖維染色后為藍(lán)色。顯微鏡下,假手術(shù)組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,肝索、肝竇清晰,僅在肝匯管區(qū)見少量膠原纖維(見圖3-A)。模型組(2周)大鼠肝組織匯管區(qū)周圍和肝小葉內(nèi)可見增多的膠原纖維(見圖3-B)。膽總管結(jié)扎4周以后,中央靜脈以及匯管區(qū)的纖維條索向外延伸、相互交聯(lián),肝小葉結(jié)構(gòu)被延伸的膠原纖維分割破壞,形成假小葉(見圖3-D)。甘參復(fù)方組(2周)肝臟纖維增生較模型組減輕(見圖3-C),甘參復(fù)方組(4周)肝組織的結(jié)構(gòu)紊亂減輕,增生的膽管以及纖維組織增生較模型組(4周)明顯減少(見圖3-E)。分析CVF發(fā)現(xiàn),模型組(2周)CVF與假手術(shù)組相比,差異顯著(P<0.001);甘參復(fù)方組(2周)的CVF與模型組(2周)相比,明顯減少,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組(4周)CVF與假手術(shù)組相比,顯著增加(P<0.001);甘參復(fù)方給藥4周后,CVF與模型組(4周)顯著減少(P<0.001)。(見表3)2. 甘參復(fù)方對(duì)肝組織TNF-α的影響
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本文編號(hào)：2871494