目的:黃芪品質(zhì)以有豆腥氣為佳�，F(xiàn)代研究表明,豆腥氣成分可作為信號(hào)分子,參與植物生長(zhǎng)與次生代謝等過程。課題組前期研究表明,與豆腥氣濃淡緊密相關(guān)的正己醛具有抑制黃芪幼苗生長(zhǎng)、促進(jìn)根多種活性成分積累的作用。本論文即在課題組已有研究的基礎(chǔ)上,首先建立微量樣品堿處理測(cè)定黃芪皂苷IV、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量方法,為微量樣品如黃芪組織培養(yǎng)物、盆栽幼苗等材料中相關(guān)成分的定量分析提供一種簡(jiǎn)單可行的方法。其次,以平地移栽黃芪為材料,進(jìn)一步研究正己醛處理對(duì)黃芪活性成分積累的影響。此外,我們對(duì)正己醛介導(dǎo)盆栽黃芪生長(zhǎng)與次生代謝的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探索,并對(duì)萜類合成酶基因進(jìn)行了挖掘和生物信息學(xué)分析。該研究對(duì)于進(jìn)一步研究豆腥氣成分在黃芪藥材活性成分合成積累中的作用及其機(jī)制具有重要意義。方法:1.取0.15 g傳統(tǒng)采收期黃芪根,按1:30的比例加入70%乙醇(內(nèi)含不同濃度的氨水),超聲提取,以黃芪皂苷IV作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行堿處理體系的優(yōu)化。利用UPLC-QTRAP-MS多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式,采用BEH C18(2.1×50 mm,1.8μm,Waters)色譜柱,以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫。流速:0.2 mL·min~(-1),柱溫:30℃,進(jìn)樣量:3μL,測(cè)定黃芪皂苷IV含量;2015版《中華人民共和國(guó)藥典》第一部中黃芪含量測(cè)定項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜條件,HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量;UPLC-Q-TOF-MS法進(jìn)行化合物的指認(rèn)與表征。2.以2年生平地移栽黃芪為實(shí)驗(yàn)材料,采用單株根施方式,進(jìn)行正己醛處理,劑量分別為5μL/株(實(shí)驗(yàn)組1)和10μL/株(實(shí)驗(yàn)組2)。每個(gè)處理20株,包括2個(gè)生物學(xué)重復(fù),以具有相同擾動(dòng)者作為空白對(duì)照。處理時(shí)間分別為:2016年6月29日、7月23日、9月13日上午9:00。2016年11月初采挖黃芪根,陰干后利用“1”方法進(jìn)行含量測(cè)定。3.以50μM正己醛處理組和對(duì)照組盆栽蒙古黃芪幼苗為材料,利用二代測(cè)序技術(shù)構(gòu)建蒙古黃芪轉(zhuǎn)錄組文庫。通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和pathway富集分析,并通過比對(duì)萜烯初生與次生物質(zhì)特別是三萜皂苷合成酶基因表達(dá),初步闡釋正己醛介導(dǎo)蒙古黃芪生長(zhǎng)與次生代謝作用機(jī)制。4.根據(jù)“3”轉(zhuǎn)錄組文庫基因注釋信息進(jìn)行萜類合成酶(terpene synthase,TPS)基因初步查找、BLAST同源比對(duì)確認(rèn)。采用MEGA4軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,在線工具ORF finder、Compute pI/Mw、ProtComp 9.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析。以環(huán)阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因?yàn)槔?以蒙古黃芪不定根為材料,我們初步分析了正己醛處理對(duì)其表達(dá)的影響。結(jié)果:1.含4%氨水的70%乙醇提取時(shí),三質(zhì)控指標(biāo)成分收率最高,對(duì)應(yīng)的檢測(cè)線性范圍分別為:10.70~85.60μg·mL~(-1)、1.039~72.73μg·mL~(-1)和1.051~73.57μg·mL~(-1)。該體系中,黃芪皂苷Ⅰ、�；锂慄S酮葡萄糖苷和芒柄花苷轉(zhuǎn)化較完全,黃芪皂苷Ⅱ部分轉(zhuǎn)化。2.與對(duì)照組相比,正己醛處理促進(jìn)了黃芪藥材中黃芪皂苷IV積累,但對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和多糖積累無顯著影響。3.從構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫中共獲得82,619條Unigenes,核苷酸總長(zhǎng)度為90,944,019 nt,總注釋率達(dá)75.72%。5,791個(gè)差異表達(dá)基因中,其中2,518個(gè)基因注釋至125條pathways,注釋至“代謝途徑”和“次生代謝物質(zhì)合成”的數(shù)量最多。根據(jù)注釋至“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”途徑中差異表達(dá)基因信息,繪制得信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,發(fā)現(xiàn)正己醛介導(dǎo)涉及到多條生長(zhǎng)與防御信號(hào)途徑。此外,除MVA途徑三萜皂苷合成酶基因表達(dá)發(fā)生改變外,與葉綠素、赤霉素、脫落酸等合成有關(guān)的MEP途徑酶基因表達(dá)亦發(fā)生改變。4.從黃芪轉(zhuǎn)錄組文庫中共鑒定得76條TPSs,其中13條擁有完整的開放閱讀框。其中,注釋為TPS10基因數(shù)量最多,其次為大根香葉稀D合成酶(germacrene D synase)和單萜合成酶(Monoterpene synthase)。選取17條代表性TPSs進(jìn)行氨基酸序列同源性分析,發(fā)現(xiàn)黃芪TPSs分為三個(gè)亞族,每一亞族均包括Ⅰ型和Ⅱ型萜類環(huán)化酶。共挖掘得3條CASs,亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在黃芪不定根中均有表達(dá),且正己醛具有上調(diào)CAS2、CAS3基因表達(dá)的作用。結(jié)論:1.建立了一種堿處理微量樣品測(cè)定黃芪皂苷IV、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量的方法,該方法顯著提高了黃芪藥材中三質(zhì)控指標(biāo)成分的收率。2.正己醛具有促進(jìn)平地移栽黃芪藥材黃芪皂苷IV積累的作用。3.多條生長(zhǎng)與防御信號(hào)途徑參與正己醛介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,除三萜皂苷合成酶基因表達(dá)受到顯著調(diào)控外,MEP途徑合成的多種初生代謝萜烯類化合物合成酶基因表達(dá)也發(fā)生改變。4.鑒定得17條代表性TPSs,其中CASs定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,與三萜皂苷細(xì)胞質(zhì)中MVA合成特征一致,正己醛具有上調(diào)CASs表達(dá)的作用。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文別為 0.021 和 0.071 μg·mL-1。芒柄花苷的回歸方程為：y=3.8894x+2.6454，R2=0.9998，線性范圍為 1.051~73.57 μg·mL-1，LOD 和 LOQ 分別為 0.017 和 0.057 μg·mL-1。表 1-2 標(biāo)品質(zhì)量與峰面積的關(guān)系黃芪皂苷Ⅳ 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 芒柄花苷編號(hào) 含量（ng） 峰面積 含量（ng） 峰面積 含量（ng） 峰面積No.1 32.1 903.025 10.39 31.697 10.51 41.477No.2 64.2 1111.1 20.78 57.686 21.02 78.543No.3 102.72 1323.275 103.9 327.609 105.1 437.596No.4 128.4 1492.4 207.8 591.294 210.2 805.524No.5 192.6 1765.05 519.5 1458.477 525.5 2031.709No.6 256.8 2210.925 727.3 2040.486 735.7 2875.35峰

就黃芪皂苷Ⅱ而言，堿處理導(dǎo)致黃芪皂苷Ⅱ與異黃芪皂苷Ⅱ（No.8 和 No.9）響應(yīng)減弱或消失，提示黃芪皂苷Ⅱ轉(zhuǎn)化不徹底。此外，堿處理還引起黃芪皂苷Ⅱ未知衍生物（No.10）的明顯轉(zhuǎn)化。該衍生物除具有黃芪皂苷Ⅱ的特征碎片外，還存在失去乙酰基團(tuán)和環(huán)開裂形成的減小 CO 的離子碎片，具體信息見附表 1。正、負(fù)離子模式下，堿處理樣品中均未檢測(cè)到黃芪皂苷 I 及其異構(gòu)體（No.11 和 No.12），提示優(yōu)化后的堿處理體系中黃芪皂苷 I 轉(zhuǎn)化較為完全。2.4 堿處理對(duì)潛在的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷�；a(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果“2.1”表明，除黃芪皂苷 IV 外，堿處理還導(dǎo)致毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷收率顯著增加。這種增加是否與二者�；a(chǎn)物在堿性條件下的脫酰基化作用有圖 1-2 堿處理對(duì)黃芪藥材中具環(huán)黃芪醇結(jié)構(gòu)化合物轉(zhuǎn)化的影響；（A）對(duì)照樣品；（B）堿處理樣品

13苷芒苷丙二酰產(chǎn)物，我們推測(cè)異黃酮化合物中的丙二酰基較為一步研究確認(rèn)。圖 1-4 堿處理對(duì)含有芒柄花苷苷元結(jié)構(gòu)化合物轉(zhuǎn)化的影響（A）對(duì)照樣品；（B）堿處理樣品
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 王凌健;方欣;楊長(zhǎng)青;李建戌;陳曉亞;;植物萜類次生代謝及其調(diào)控[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2013年12期

2 商蕾;曲章義;寧莉莉;王迎晨;魏鳳香;高虹;魯偉君;;黃芪甲苷體外抗腺病毒作用研究[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2013年06期

3 凌洪鋒,蘇丹,曹洋;黃芪多糖抗氧化作用研究[J];醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐;2005年08期

4 黃雅芬,余龍江,蘭文智,楊希;脂氧合酶在誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)紫杉醇中的作用[J];西北植物學(xué)報(bào);2004年10期

5 江蔚新,葛坤如,薛寶玉;不同種類黃芪根中有效成分的比較[J];哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年04期

6 王要軍,權(quán)啟鎮(zhèn),孫自勤,齊鳳,江學(xué)良,張修禮,王東;黃芪對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化組織ICAM-1表達(dá)影響的免疫組化研究[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2000年01期

本文編號(hào)：2870918