目的:探討慈姑多糖(SSP)干預(yù)小鼠異煙肼和利福平聯(lián)用(INH/RFP)藥物性肝損傷以及小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用,并基于非靶向代謝組學(xué)方法,探討SSP干預(yù)INH/RFP肝損傷小鼠和NAFLD小鼠后的血清代謝物譜,挖掘SSP干預(yù)肝損傷作用的特異性生物標(biāo)志物,以探究SSP保肝作用的分子機(jī)制,為SSP開(kāi)發(fā)為保肝產(chǎn)品提供試驗(yàn)依據(jù)。方法:1慈姑多糖對(duì)異煙肼和利福平聯(lián)用小鼠肝損傷的保護(hù)作用及代謝組學(xué)研究1.1慈姑多糖對(duì)異煙肼和利福平聯(lián)用小鼠肝損傷的保護(hù)作用24只BALB/C小鼠(20±2g)隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)、模型組(10只)、多糖組(8只)。采用INH/RFP造模,造模同時(shí)對(duì)多糖組灌胃SSP進(jìn)行干預(yù)。所有小鼠每天灌胃2次,第1次為對(duì)照組和模型組灌胃生理鹽水(0.8g/kg),多糖組灌胃SSP(0.8g/kg),4小時(shí)候后第2次灌胃,對(duì)照組灌胃生理鹽水(0.2g/kg),模型組和多糖組灌胃INH(0.1g/kg)+RFP(0.1g/kg)。持續(xù)30天。所有小鼠禁食12小時(shí),稱(chēng)重并處死。然后收集血液和肝臟樣本。眼球取血后將血液離心獲得血清。分別采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量的檢測(cè)以及采用HE染色方法進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查,明確模型是否復(fù)制成功,并評(píng)價(jià)SSP對(duì)INH/RFP導(dǎo)致肝損傷的保護(hù)作用。1.2慈姑多糖對(duì)異煙肼和利福平聯(lián)用小鼠肝損傷的血清代謝組學(xué)研究分組及給藥同1.1。采用UPLC-HRMS方法分析SSP干預(yù)INH/RFP聯(lián)用肝損傷小鼠的血清樣本,獲取血清代謝物譜,并采用主成分分析(PCA)方法結(jié)合偏最小二乘(PLS-DA)方法挖掘可能的SSP干預(yù)肝損傷作用的特異性生物標(biāo)志物,探究SSP保護(hù)作用機(jī)制,并采用免疫組化方法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶(HO-1)蛋白表達(dá)水平,從而對(duì)代謝組學(xué)研究結(jié)果中的三羧酸循環(huán)通路進(jìn)行驗(yàn)證。2慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝損傷的保護(hù)作用及代謝組學(xué)研究2.1慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝損傷的保護(hù)作用2.1.1評(píng)價(jià)慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠糖脂代謝及炎癥的影響24只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為3組(每組8只):對(duì)照組飼喂普通飼料+灌胃生理鹽水(0.8g/kg)、模型組飼喂蛋氨酸-膽堿缺乏飼料(MCD)+灌胃生理鹽水(0.8g/kg)、多糖組飼喂MCD飼料+灌胃SSP(0.8g/kg)。飼養(yǎng)12周后,所有小鼠禁食12h,稱(chēng)量體重,進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。結(jié)束后麻醉,眼球取血,離心血液為血清,并取出肝組織。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、空腹血糖(FBG)、游離脂肪酸(FFA)含量;采用熒光定量PCR技術(shù)(RT-QPCR)檢測(cè)肝組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL-6)、過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同激活因子-1α(PGC-1α)mRNA的表達(dá);采用HE染色、油紅O染色方法進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查。2.1.2評(píng)價(jià)慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響分組及給藥同2.1.1。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量變化;采用熒光定量PCR技術(shù)(RT-QPCR)檢測(cè)肝組織促凋亡蛋白(Bax)、抑制凋亡蛋白(Bcl-2)、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)、Nrf2、HO-1mRNA水平的變化;采用透射電鏡進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查;采用Western-blot方法對(duì)Nrf2蛋白進(jìn)行檢測(cè)。2.2慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝保護(hù)作用的代謝組學(xué)研究分組及給藥同2.1.1。采用UPLC-HRMS方法分析SSP干預(yù)非酒精性脂肪肝小鼠的血清樣本,獲取血清代謝物譜,并采用PCA方法結(jié)合正交偏最小二乘(OPLS-DA)方法挖掘可能的SSP干預(yù)肝損傷作用的特異性生物標(biāo)志物,尋找標(biāo)志代謝物,探究SSP保護(hù)作用機(jī)制,并采用免疫組化方法檢測(cè)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平,從而對(duì)代謝組學(xué)研究結(jié)果中的花生四烯酸代謝通路進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:1慈姑多糖對(duì)異煙肼和利福平聯(lián)用小鼠肝損傷的保護(hù)作用及代謝組學(xué)研究1.1慈姑多糖對(duì)異煙肼和利福平聯(lián)用小鼠肝損傷的保護(hù)作用血清生化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組AST、ALT含量升高(P0.01);與模型組相比,多糖組AST、ALT含量降低(P0.05)。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于對(duì)照組,模型組肝組織出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)與壞死灶;與模型組相比,多糖組肝組織炎性浸潤(rùn)和壞死改善。1.2慈姑多糖對(duì)異煙肼和利福平聯(lián)用小鼠肝損傷保護(hù)作用的代謝組學(xué)研究UPLC-HRMS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SSP能夠引起棕櫚酸、鳥(niǎo)氨酸、天冬氨酸、琥珀酸、延胡索酸等14種代謝物水平的改變,與調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)、鳥(niǎo)氨酸循環(huán)、氨基酸循環(huán)等代謝通路相關(guān)。免疫組化方法對(duì)三羧酸循環(huán)通路進(jìn)行驗(yàn)證,分析發(fā)現(xiàn)SSP引起Nrf2、HO-1表達(dá)的上調(diào),表明SSP能夠引起三羧酸循環(huán)通路上調(diào)的的研究結(jié)果可信度較高。2慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝損傷的保護(hù)作用及代謝組學(xué)研究2.1慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝損傷的保護(hù)作用2.1.1評(píng)價(jià)慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝糖脂代謝及炎癥的影響模型組小鼠體重與對(duì)照組相比顯著降低(P0.05),模型組與多糖組無(wú)差異。相比于對(duì)照組,模型組小鼠葡萄糖耐受能力顯著下降,多糖組小鼠葡萄糖耐受能力相比于對(duì)照組顯著降低,但高于模型組。血清生化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清TG、TC、FBG、FFA水平顯著升高(P0.05);與模型組相比,多糖組小鼠血清TG、TC、FPG、FFA水平顯著降低(P0.05或P0.01)。HE染色結(jié)果顯示模型組小鼠肝組織呈中度脂肪變性,同時(shí)伴有炎癥和壞死;多糖組脂肪變性得到改善。油紅O染色結(jié)果表明,模型組肝組織脂肪變性明顯,多糖組脂肪變性得到改善。RT-QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組,模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P0.05),PGC-1α mRNA表達(dá)降低(P0.01);相比于模型組,多糖組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)顯著降低(P0.05或P0.01),PGC-1α mRNA表達(dá)升高(P0.01)2.1.2評(píng)價(jià)慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞凋亡的影響血清生化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清ALT、AST、LDLC水平顯著升高(P0.01);HDLC水平顯著降低(P0.05)。與模型組相比,多糖組小鼠血清ALT、AST、LDLC水平顯著降低(P0.05或P0.01);HDLC水平顯著升高(P0.05)。透射電鏡觀(guān)察肝組織線(xiàn)粒體,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹、變形、線(xiàn)粒體嵴消失等表現(xiàn),多糖組線(xiàn)粒體腫脹、變形、線(xiàn)粒體嵴消失等損傷得到改善。RT-QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組,模型組小鼠肝組織中Bax mRNA表達(dá)升高(P0.01),Bcl-2、Sirt1、Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)降低(P0.05);相比于模型組,多糖組小鼠肝組織中Bax mRNA表達(dá)減低(P0.01),Bcl-2、Sirt1、Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)升高(P0.05)。Western-blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Nrf2蛋白在模型組中表達(dá)降低(P0.05),在多糖組中升高(P0.05)。2.2慈姑多糖對(duì)非酒精性脂肪肝保護(hù)作用的代謝組學(xué)研究UPLC-HRMS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SSP能夠引起棕櫚酸、花生四烯酸、白三烯A4、白三烯B4等33種代謝物水平的改變,并調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝通路。免疫組化方法分析發(fā)現(xiàn)SSP引起Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的上調(diào),表明SSP能夠調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝通路的結(jié)果可信度較高。結(jié)論:SSP對(duì)INH/RFP小鼠肝損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)、牛磺酸代謝、支鏈氨基酸代謝和脂肪酸代謝等通路有關(guān)。SSP可能通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善炎癥、抑制肝細(xì)胞凋亡,發(fā)揮對(duì)NAFLD小鼠肝損傷的保護(hù)作用,其機(jī)制可能還與調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝途徑有關(guān)。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：
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本文編號(hào)：
2870883
