發(fā)布時間：2020-11-01 22:13

　　 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒感染引起的一種重大傳染性疾病,其慢性感染會導致患者出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等一系列嚴重疾病。近年來針對病毒蛋白的直接抗病毒藥物(DAAs)的研發(fā)取得了巨大進展,但DDAs引發(fā)的耐藥、HCV合并HBV或HIV感染的治療、特殊人群感染的治療等諸多問題,迫使我們仍需尋找新型的抗HCV藥物。本論文利用本室建立的HCV蛋白酶抑制劑高通量篩選模型,對國家新藥(微生物)篩選實驗室樣品庫中的樣品進行篩選,發(fā)現(xiàn)黃芩素及黃芩苷具有抗HCV NS3/4A蛋白酶活性。研究報道黃芩苷及黃芩素具有抗呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒(NDV)、流感病毒(H1N1)、登革熱病毒(DENV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等多種病毒的作用,然而其作用機制不明確,也尚未見其有直接抗HCV活性的研究報道。所以本論文利用本室建立的一系列抗HCV藥物研發(fā)模型對黃芩苷的抗HCV活性做了深入研究。本論文研究結果顯示,黃芩苷具有抗HCV NS3/4A蛋白酶的活性,其抑制蛋白酶的Ki值為63.22±0.98μM。由于NS3蛋白還具有解旋酶的活性,為分析黃芩苷對NS3解旋酶是否還具有影響作用,本論文建立了HCV解旋酶抑制劑高通量篩選模型,優(yōu)化了反應條件。隨后利用此模型分析顯示黃芩苷對HCV解旋酶無抑制作用,提示黃芩苷對HCV NS3/4A蛋白的蛋白酶活性具有特異性。為進一步分析黃芩苷抗HCV的活性,本論文首先檢測了黃芩苷在細胞培養(yǎng)內對急性感染HCV復制的影響。結果顯示,黃芩苷在Huh7.5細胞內具有抗急性感染HCV復制的作用,其對細胞的毒性的CC_(50)為781.7±144.1μM,抑制HCV復制的EC_(50)為31.3±9.56μM,其抑制活性在蛋白表達水平上也得到確證。DAA治療常出現(xiàn)耐藥,常見的有如A156T和D168V的蛋白酶抑制劑耐藥突變位點及S282T的多聚酶抑制劑耐藥突變位點,為分析黃芩苷對耐藥病毒的治療作用,本論文首先進行了耐藥突變HCV病毒株的建立及驗證。結果顯示,已成功建立了蛋白酶抑制劑和多聚酶抑制劑耐藥突變病毒及其實驗分析方法,其耐藥倍數(shù)分別為40、34和4倍,而黃芩苷對耐藥突變HCV病毒株的活性與其對野生型病毒的活性相似,提示黃芩苷對耐藥突變HCV病毒株也具有治療作用。為了進一步分析黃芩苷在抗HCV方面的可應用性,本論文初探了黃芩苷與已知臨床應用的抗病毒藥物的聯(lián)合抗HCV活性。結果顯示,黃芩苷與蛋白酶抑制劑simeprevir聯(lián)用存在拮抗作用,但黃芩苷與多聚酶抑制劑sofosbuvir聯(lián)用則有協(xié)同抗病毒作用。結論:黃芩苷在細胞培養(yǎng)內具有抗HCV的作用,對已知常見耐藥病毒也有效,與不同作用靶點的藥物具有協(xié)同抗病毒的作用,其抗病毒作用機制可能是通過特異性地抑制HCV蛋白酶。
【學位單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

北京工業(yè)大學工程碩士專業(yè)學位論文合的膜蛋白，NS5A 是高度磷酸化的蛋白，形成 RNA 復制復合體，與復關。NS4B 和NS5A 的具體功能尚不明確，NS5B 是一個 RNA 依賴的 RN合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）[12-16]。另外，存在一種閱替代蛋白(alternative reading frame protein，ARFP)，又稱 F(frameshift)蛋白翻譯過程中Core蛋白編碼序列的核糖體閱讀框發(fā)生-2 或+1 位移所致[17,18]。

圖 1- 2. HCV 的生命周期CV基因組具有多樣性，到目前為止已經(jīng)檢測到七種基因型[21][22]，每因序列差異為 31%~33%，每個亞型間的差異達 20%~25%[23-25]。因型分布不同[26]論上講，阻斷HCV復制周期中任何一個環(huán)節(jié)都可抑制病毒復制，段、HCV復制階段、HCV釋放階段等。在以干擾素（Interferon ,療時代之后，開發(fā)了一系列稱為直接作用于病毒的抗病t-acting antiviral agents，DAA）。目前已知抗HCV藥物可分為三蛋白酶抑制劑、NS5B聚合酶抑制劑和NS5A抑制劑，如表 1-1 �；蛐� 1 在美洲，歐洲，澳大利亞，新西蘭，區(qū)更為普遍�；蛐� 3 在印度和巴基斯坦最常見，基因型 4 以南位�；蛐� 5 占南非HCV感染的三分之一，而基因型 6 主要在 5 月美國 FDA 批準上市的第一代 DAAs-特拉匹韋（Telaprev匹韋（Boceprevir, BOC），這類藥物治療會造成嚴重甚至致死的第一代DAAs極易誘導HCV病毒耐藥突變[28,29]最終常造成治療的

第 4 章 實驗結果第 4 章 實驗結果4.1 HCV蛋白酶抑制劑的篩選及黃芩苷抑制HCV蛋白酶的活性4.1.1 HCVNS3/4A 蛋白酶提取將帶有表達融合麥芽糖的HCV NS3/4A蛋白（1a型）的質粒pMAL-c2-NS3/4A轉化菌DH5α菌株，在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中 37℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600≈0.6 時，加入IPTG誘導培養(yǎng) 4 h。離心收集菌株后，于冰浴中超聲破碎并收集上清。在 4℃層析柜中用AKTA監(jiān)測分離純化(圖 4-1）。如圖 3 所示，當用含有麥芽糖的緩沖液洗脫已經(jīng)吸附了HCV NS3/4A融合蛋白的Amylose Resin填料時，AKTA的紫外監(jiān)測系統(tǒng)顯示有紫外峰值，調整收集器收集此部分洗脫液，得到HCVNS3/4A蛋白樣品。
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本文編號：2866174