目的隨著人口老年化進(jìn)程加快,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病日趨嚴(yán)峻。研究認(rèn)為,神經(jīng)退行性疾病發(fā)生與發(fā)展與神經(jīng)干細(xì)胞衰老密切相關(guān),遺憾的是迄今還沒有找到有效防止神經(jīng)退行性疾病途徑。中醫(yī)臨床的實(shí)踐證明,可以通過“補(bǔ)益氣血”途徑有效延緩機(jī)體衰老。當(dāng)歸是中醫(yī)臨床“補(bǔ)血”要藥,有“補(bǔ)益氣血,延緩衰老,修復(fù)損傷”等作用。本研究通過構(gòu)建D-半乳糖(D-gal)所致Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠腦衰老模型和神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)體外衰老模型,探討當(dāng)歸多糖(ASP)拮抗D-gal所致Nestin-GFP小鼠腦衰老作用及相關(guān)機(jī)制。方法1.雄性Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠60只,隨機(jī)分為4組。腦衰老模型組:小鼠頸背部皮下注射D-gal(200mg/kg qd×42);ASP腦衰老模型組:在衰老模型組建立的基礎(chǔ)上,從第16d起給與腹腔注射ASP(140mg/kg qd×27);ASP正常組:頸背部皮下注射生理鹽水(等時(shí)、等量),第16d起腹腔注射ASP(劑量與時(shí)間同上);正常組:小鼠頸背部皮下注射等量生理鹽水42d。各組給藥完成第2d檢測以下指標(biāo):(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力;(2)取各組小鼠海馬,制備冷凍切片,觀察海馬區(qū)NSCs熒光強(qiáng)度;(3)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色觀察各組海馬組織中染色陽性細(xì)胞百分率;(4)酶標(biāo)比色法檢測海馬區(qū)超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量以及Na+-K+-ATP酶活力;(5)ELISA檢測各組海馬區(qū)IL-1β,IL-6和TNF-a炎癥因子變化;(6)Western Blot檢測海馬組織P53、P21含量變化。2.從Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因乳鼠腦中分離提取NSCs,原代培養(yǎng)至P3代。檢測以下指標(biāo):(1)采用不同濃度的ASP(10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml,160μg/ml)分別作用P3代NSCs,培養(yǎng)24h、48h、72h后,采用CCK-8檢測各組NSCs增殖能力。(2)取培養(yǎng)P3代的NSCs,隨機(jī)分為四組。正常組:常規(guī)培養(yǎng)72h;ASP正常組:常規(guī)培養(yǎng)24h,加入ASP(100μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48h;衰老組:常規(guī)培養(yǎng)體系加入D-gal(20mg/ml)培養(yǎng)24h,致衰后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48h;ASP衰老組:按衰老組方法培養(yǎng)細(xì)胞,24h后再加入ASP(100μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48h。衰老細(xì)胞模型建立后,檢測以下指標(biāo):1)熒光顯微鏡觀察Nestin免疫熒光鑒別NSCs;2)計(jì)數(shù)各組NSCs的SA-β-gal染色陽性神經(jīng)球數(shù)目;3)酶標(biāo)比色法檢測各組SOD、T-AOC和MDA含量,流式細(xì)胞儀檢測NSCs內(nèi)ROS水平;4)ELISA檢測各組IL-1β,IL-6和TNF-a炎癥因子變化;5)Western Blot檢測NSCs內(nèi)P53、P21含量變化。結(jié)果1.體內(nèi)結(jié)果1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,衰老組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低,而ASP拮抗衰老組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善;2)免疫熒光觀察結(jié)果顯示,衰老組小鼠海馬DG區(qū)Nestin-GFP熒光強(qiáng)度明顯度降低,而ASP拮抗衰老組小鼠海馬DG區(qū)Nestin-GFP熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng);3)SA-β-Gal染色結(jié)果顯示,衰老組小鼠海馬組織中SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞百分率明顯增加,而ASP拮抗衰老組小鼠海馬組織中SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞百分率明顯下降;4)酶標(biāo)比色法檢測顯示,衰老組小鼠海馬組織中SOD活性和T-AOC降低,MDA含量升高,Na+-K+-ATP酶活力降低;而ASP拮抗衰老組小鼠海馬組織中SOD活性和T-AOC提高,MDA含量下降,Na+-K+-ATP酶活力增強(qiáng);5)ELISA檢測結(jié)果顯示,衰老組小鼠海馬組織中IL-1β,IL-6和TNF-a含量增多,而ASP拮抗衰老組小鼠海馬組織中IL-1β,IL-6和TNF-a含量明顯下降;6)Western Blot檢測顯示,衰老組小鼠海馬組織P53、P21含量升高,ASP拮抗衰老組小鼠海馬組織P53、P21含量降低。2.體外結(jié)果1)熒光顯微鏡觀察Nestin免疫熒光鑒別NSCs,體外培養(yǎng)的神經(jīng)球呈現(xiàn)Nestin綠色熒光陽性反應(yīng);2)ASP體外作用NSCs可提高起NSCs增殖能力,并且NSCs增殖能力與ASP濃度成正相關(guān);3)SA-β-Gal染色結(jié)果顯示,衰老模型組NSCs的SA-β-gal染色陽性神經(jīng)球數(shù)目增多,而APS拮抗衰老組NSCs的SA-β-gal染色陽性神經(jīng)球數(shù)目降低;4)酶標(biāo)比色法檢測結(jié)果顯示,衰老組NSCs培養(yǎng)上清液中SOD活性和T-AOC降低,MDA含量升高,流式細(xì)胞儀檢測NSCs內(nèi)ROS水平提高;而APS拮抗衰老組SOD活性和T-AOC提高,MDA含量降低,NSCs內(nèi)ROS水平降低;5)ELISA檢測結(jié)果顯示,衰老組NSCs培養(yǎng)上清液中IL-1β,IL-6和TNF-a含量增多,而APS拮抗衰老組NSCs培養(yǎng)上清液中IL-1β,IL-6和TNF-a含量下降;6)Western Blot檢測結(jié)果顯示,衰老組NSCs衰老相關(guān)P53、P21蛋白含量增加,而APS拮抗衰老組NSCs衰老相關(guān)P53、P21蛋白含量降低。結(jié)論1、本研究采用D-gal復(fù)制的模型確為腦衰老模型2、ASP能拮抗D-Gal所致小鼠腦衰老,其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激損傷、下調(diào)炎癥因子水平及衰老相關(guān)基因、維持海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。3、ASP能在體外拮抗D-gal誘導(dǎo)的NSCs衰老,其機(jī)制可能與ASP調(diào)節(jié)NSCs氧化與抗氧化能力,調(diào)控衰老相關(guān)基因有關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1.1 ASP 對腦衰老小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響 (x±s，n = 15)Fig1.1 Effects of ASP on the escape latency in spatial orientation test of bra( ±s，n = 15)圖 1.2 ASP 對腦衰老小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響( ±s，n = 15)Fig1.2 Effect of ASP on space exploration test of brain aging mice( ±s，n =腦衰老模型組與正常組相比(Comparison between D-gal group and norma

18圖 1.2 ASP 對腦衰老小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響( ±s，n = 15)Fig1.2 Effect of ASP on space exploration test of brain aging mice( ±s，n = 15)腦衰老模型組與正常組相比(Comparison between D-gal group and normal group)，#P<0.05；ASP 腦衰老模型組與腦衰老模型組相比(Comparison between ASP+D-gal group andD-gal group)，*P<0.052.2 ASP 能降低腦衰老小鼠海馬 CA3 區(qū) SA-β-Gal 染色陽性強(qiáng)度

圖 1.3ASP 對腦衰老小鼠海馬 CA3 區(qū)細(xì)胞衰老的影響 (SA-β-Gal 染色，×100)Fig1. 3 Effects of ASP on aging stain in area CA3 in hippocampus of brain-aged mice(SA-β-Gal staining, ×100)A.正常組(Normal group)；B. ASP 正常組(ASP normal group)； C. ASP 腦衰老模型組(ASP+D-gal group)；D. 腦衰老模型組(D-gal group)
【參考文獻(xiàn)】

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1 姜蓉;張夢思;賈道勇;張巖巖;夏婕妤;鄒婷;葉劍文;王璐;王亞平;;當(dāng)歸多糖拮抗致衰劑對大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能的保護(hù)作用[J];解剖學(xué)報(bào);2016年02期

2 樊艷玲;夏婕妤;賈道勇;張夢思;張巖巖;王璐;黃國寧;王亞平;;當(dāng)歸多糖對D-半乳糖致小鼠腎臟亞急性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J];中國中藥雜志;2015年21期

3 張夢思;鄒婷;葉淵文;賈道勇;張巖巖;王亞平;;當(dāng)歸多糖對衰老模型大鼠脾臟結(jié)構(gòu)與功能的影響[J];解剖學(xué)報(bào);2015年02期

4 張巖巖;李靜;賈道勇;張夢思;徐春燕;景鵬偉;李成鵬;王璐;王順和;王亞平;;當(dāng)歸多糖對衰老模型大鼠骨髓造血功能的影響及其機(jī)制[J];解剖學(xué)報(bào);2014年06期

5 李成鵬;張夢思;劉俊;耿珊;李靜;朱家紅;張巖巖;賈道勇;王璐;王順和;王亞平;;人參皂苷Rg_1延緩腦衰老機(jī)制研究[J];中國中藥雜志;2014年22期

6 張夢思;徐春燕;朱家紅;賈道勇;劉俊;張巖巖;姜蓉;王璐;王亞平;;當(dāng)歸多糖與阿糖胞苷聯(lián)合注射對人白血病模型小鼠脾臟結(jié)構(gòu)與功能的影響[J];中藥藥理與臨床;2014年04期

7 單莎瑞;黃國志;;干細(xì)胞抗衰老的理論研究與進(jìn)展[J];中國組織工程研究;2013年23期

8 彭彬;王朝麗;馮麗;王亞平;;人參皂苷Rg1調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞衰老作用及機(jī)制探討[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年10期

9 高俊瑋;伍軍;柳浩然;陳長青;方芳;周向陽;方加勝;;胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定[J];中國神經(jīng)精神疾病雜志;2005年05期

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2 肖政權(quán);Nestin陽性小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型的建立及病理學(xué)觀察[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

3 張燕;TNF-α和IL-6在老年性聾動(dòng)物模型衰老過程中的表達(dá)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2865977