在全球范圍內(nèi),胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5位,死亡率居第3位;結(jié)直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第3位,死亡率居第2位。中醫(yī)藥在腫瘤的治療中應(yīng)用廣泛,具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。同時(shí),由于中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑協(xié)同作用的復(fù)雜性及傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法的局限性,大多數(shù)中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、分子靶標(biāo)及作用機(jī)制仍然不明確,這成為中藥應(yīng)用和中藥新藥研發(fā)的主要障礙之一。白花蛇舌草是中醫(yī)常用的清熱類藥,具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿除濕等功效,臨床上廣泛應(yīng)用于胃腸道癌的治療,然而其作用機(jī)制尚未充分闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”多層次、多角度的相互作用網(wǎng)絡(luò)為理念,系統(tǒng)綜合地觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響,已廣泛應(yīng)用于中藥作用機(jī)制的研究�；诖�,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索白花蛇舌草抗胃腸道癌的作用機(jī)制。研究目的通過整合基因表達(dá)譜分析確認(rèn)胃腸道癌潛在預(yù)后標(biāo)志物。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測、辨識(shí)白花蛇舌草治療胃腸道癌的活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,構(gòu)建生物分子網(wǎng)絡(luò),力求從系統(tǒng)層面揭示白花蛇舌草抗胃腸道癌的多成分、多靶點(diǎn)、多通路復(fù)雜機(jī)制。研究方法1.整合基因表達(dá)譜分析在基于整合基因表達(dá)譜的胃癌潛在預(yù)后標(biāo)志物研究中,從GEO數(shù)據(jù)庫下載9個(gè)胃癌基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集,利用R語言中的limma包對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行差異表達(dá)分析,進(jìn)一步通過RobustRankAggreg包進(jìn)行整合分析,篩選出在9個(gè)數(shù)據(jù)集中共同被確認(rèn)為差異表達(dá)的基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃腺癌mRNA測序數(shù)據(jù)和病人的臨床信息,利用edgeR包確認(rèn)差異表達(dá)基因,并將這些基因與胃癌芯片數(shù)據(jù)集整合分析得到的差異基因取交集,篩選共同的差異基因。使用STRING獲取差異基因的蛋白相互作用信息,導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),并利用MCODE進(jìn)行模塊分析,獲得網(wǎng)絡(luò)的核心基因。通過DAVID對(duì)核心模塊中的基因進(jìn)行GO富集分析,通過clusterProfiler包對(duì)核心模塊中的基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。合并TCGA中胃癌患者的生存數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù),采用survival包進(jìn)行單因素Cox回歸分析,選取P0.05的基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析�；谒x基因表達(dá)譜和回歸系數(shù)構(gòu)建生存相關(guān)的線性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型,計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)值,通過Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)的方法評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組樣本總體生存率的差異,采用時(shí)間依賴性ROC曲線評(píng)價(jià)該預(yù)后模型對(duì)時(shí)間依賴性癌癥死亡的預(yù)測準(zhǔn)確性。在基于整合基因表達(dá)譜的結(jié)直腸癌潛在預(yù)后標(biāo)志物研究中,從GEO數(shù)據(jù)庫下載6個(gè)結(jié)直腸癌基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集,利用limma包對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行差異表達(dá)分析,進(jìn)一步通過RobustRankAggreg包進(jìn)行整合分析,篩選出在6個(gè)數(shù)據(jù)集中共同被確認(rèn)為差異表達(dá)的基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫下載結(jié)腸腺癌mRNA測序數(shù)據(jù)和病人的臨床信息,利用edgeR包確認(rèn)差異表達(dá)基因,并將這些基因與結(jié)直腸癌芯片數(shù)據(jù)集整合分析得到的差異基因取交集,篩選共同的差異基因。采用KEGG的功能注釋信息,通過clusterProfiler包分別對(duì)7個(gè)數(shù)據(jù)集中的全部基因進(jìn)行GSEA富集分析。合并TCGA中結(jié)腸癌患者的生存數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù),采用survival包進(jìn)行單因素Cox回歸分析,通過glmnet包對(duì)P0.05的基因進(jìn)行LASSO Cox回歸分析,最后應(yīng)用survival包對(duì)LASSO Cox回歸分析確認(rèn)的生存相關(guān)基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析。基于所選基因表達(dá)譜和回歸系數(shù)構(gòu)建生存相關(guān)的線性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型,計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)值,通過Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)的方法評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組樣本總體生存率的差異,采用時(shí)間依賴性ROC曲線評(píng)價(jià)該預(yù)后模型對(duì)時(shí)間依賴性癌癥死亡的預(yù)測準(zhǔn)確性。2.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析在白花蛇舌草治療胃癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,通過TCMSP、TCMID獲得白花蛇舌草的化學(xué)成分,通過SuperPred預(yù)測化學(xué)成分的靶點(diǎn),通過TTD、OMIM、PharmGKB、DigSee獲得胃癌相關(guān)基因,通過STRING獲得蛋白質(zhì)相互作用信息。運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“化合物靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“胃癌蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“化合物靶點(diǎn)-胃癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”,并對(duì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。運(yùn)用MCODE對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析,識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中的核心聚類模塊。通過DAVID對(duì)模塊中的基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析。在白花蛇舌草治療結(jié)直腸癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,通過TCMSP、TCMID、TCM Database@Taiwan獲得白花蛇舌草的化學(xué)成分,通過PharmMapper預(yù)測化學(xué)成分的靶點(diǎn),通過DisGeNET獲得結(jié)直腸癌相關(guān)基因,通過STRING獲得蛋白質(zhì)相互作用信息。運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“結(jié)直腸癌蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“化合物-結(jié)直腸癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”,對(duì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析,確認(rèn)白花蛇舌草治療結(jié)直腸癌的潛在核心靶點(diǎn),通過DAVID對(duì)其進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析。研究結(jié)果1.胃腸道癌整合基因表達(dá)譜分析結(jié)果對(duì)9個(gè)胃癌芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析,得到411個(gè)差異基因,對(duì)TCGA胃癌測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到4623個(gè)差異基因,對(duì)這些差異基因取交集,最終共得到268個(gè)共同差異基因(149個(gè)下調(diào)基因,119個(gè)上調(diào)基因)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和模塊分析得到3個(gè)核心聚類模塊和9個(gè)核心基因(TOP2A、COL1A1、COL1A2、COL3A1、NDC80、CDKN3、CEP55、TPX2、TIMP1)。功能富集分析顯示,下調(diào)基因主要參與多種代謝過程,包括異生素、輔助因子、維生素、氨基酸、碳水化合物等的代謝,上調(diào)基因主要富集在癌癥相關(guān)通路,如ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。生存分析得到9個(gè)基因構(gòu)建預(yù)后模型,3個(gè)基因(COL8A1、SMPD3、PLEKHS1)與胃癌患者生存時(shí)間呈正相關(guān),6個(gè)基因(CST2、AADAC、SERPINE1、ASPN、ITGBL1、MAP7D2)與胃癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。對(duì)6個(gè)結(jié)直腸癌芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析,得到990個(gè)差異基因,對(duì)TCGA結(jié)腸癌測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到4131個(gè)差異基因,對(duì)這些差異基因取交集,最終共得到885個(gè)共同差異基因(458個(gè)下調(diào)基因,427個(gè)上調(diào)基因)。GSEA富集分析顯示,有32條信號(hào)通路出現(xiàn)在3個(gè)或3個(gè)以上的數(shù)據(jù)集中,包括9條激活通路和23條抑制通路。生存分析得到7個(gè)基因構(gòu)建預(yù)后模型,5個(gè)基因(AXIN2、CXCL1、ITLN1、CPT2、CLDN23)與結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間呈正相關(guān),2個(gè)基因(TIMP1、LZTS3)與結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。2.白花蛇舌草抗胃腸道癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果在白花蛇舌草抗胃癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,對(duì)“化合物-化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“化合物靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“胃癌蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“化合物靶點(diǎn)-胃癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”的綜合分析顯示,碳酸酐酶、p53、PIK3CA可能是白花蛇舌草的關(guān)鍵靶點(diǎn),白花蛇舌草與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管新生相關(guān)的蛋白,如CDK2、p27Kip1、cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、p53、AKT1、BCL2、MAPK1、VEGFA、PIK3CA 等存在較強(qiáng)的聯(lián)系。GO富集和KEGG通路富集分析顯示,白花蛇舌草所調(diào)控的核心蛋白顯著富集在核苷酸切除修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等生物學(xué)過程和信號(hào)通路。通過與胃癌整合基因表達(dá)譜分析中差異基因KEGG通路富集分析的結(jié)果進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)二者共有的KEGG通路有5條,分別為細(xì)胞周期、PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、粘著斑、TNF信號(hào)通路。在白花蛇舌草抗結(jié)直腸癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,對(duì)“化合物-化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“結(jié)直腸癌蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“化合物-結(jié)直腸癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”的綜合分析得到白花蛇舌草作用于結(jié)直腸癌的10個(gè)潛在核心靶點(diǎn),分別為HRAS、PIK3CA、KRAS、p53、APC、BRAF、GSK3B、CDK2、AKT1、RAF1。GO富集分析顯示,白花蛇舌草所調(diào)控的核心靶點(diǎn)顯著富集在肽基-絲氨酸磷酸化、ERBB2信號(hào)通路、Ras蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程。KEGG通路富集分析顯示,白花蛇舌草所調(diào)控的核心靶點(diǎn)主要參與結(jié)直腸癌、癌癥信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路。通過與結(jié)直腸癌整合基因表達(dá)譜分析中GSEA富集分析的結(jié)果進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)二者共有的KEGG通路有4條,分別為MAPK信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、Rap1信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路。研究結(jié)論本研究綜合運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和整合基因表達(dá)譜分析方法,在系統(tǒng)層面揭示了白花蛇舌草抗胃腸道癌的活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,初步闡釋了白花蛇舌草抗胃癌的作用機(jī)制可能與其協(xié)同調(diào)節(jié)與胃癌的主要病理過程如細(xì)胞凋亡抵抗、細(xì)胞周期失調(diào)、細(xì)胞分化異常、細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、血管新生等密切相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān),白花蛇舌草抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制可能與其協(xié)同調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中多個(gè)常見突變基因的表達(dá)有關(guān)。本研究有助于為理解、評(píng)價(jià)中醫(yī)藥在治療復(fù)雜疾病中的協(xié)同作用及促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在探索抗癌中藥潛在作用機(jī)制中的應(yīng)用提供線索和思路。然而,由于本研究是基于數(shù)據(jù)分析開展的,因此需要進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證本研究的結(jié)果。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

本研宄納入的９個(gè)胃癌芯片數(shù)據(jù)集基本信息如表１所示。首先，通過ＲＲＡ方法對(duì)??９個(gè)芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析，得到４１１個(gè)差異表達(dá)基因，包括２３４個(gè)下調(diào)基因和１７７??個(gè)上調(diào)基因（圖２Ａ）。其次，對(duì)ＴＣＧＡ胃癌測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到４６２３個(gè)差異表達(dá)??基因，包括２２１９個(gè)下調(diào)基因和２４０４個(gè)上調(diào)基因。最后，對(duì)這些差異基因取交集，最終??共得到２６８個(gè)共同差異基因，包括１４９個(gè)下調(diào)基因和１１９個(gè)上調(diào)基因（圖２Ｂ，圖２Ｃ，??表２）。??４１??

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的白花蛇舌草治療胃腸道癌作用機(jī)制研宄??３．２功能富集分析??ＧＯ富集分析顯示，下調(diào)的差異基因顯著富集在多種與代謝相關(guān)的生物過程，而上??調(diào)的差異基因與細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)，如細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外基質(zhì)分解、細(xì)胞外基??質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等（圖３Ａ）。??ＫＥＧＧ通路富集分析顯示，下調(diào)的差異基因顯著富集在多種與代謝相關(guān)的信號(hào)通路，??如藥物代謝－細(xì)胞色素Ｐ４５０、細(xì)胞色素Ｐ４５０異生素代謝、視黃醇代謝、酪氨酸代謝等，??而上調(diào)的差異基因顯著富集在與環(huán)境信息處理和腫瘤演進(jìn)相關(guān)的通路，如細(xì)胞因子－細(xì)??胞因子受體相互作用、ＥＣＭ－受體相互作用、粘著斑等（圖３Ｂ）。??Ａ?Ｂ??

ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ?ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ?ｆａｃｔｏｒ，ＴＰＸ２?）、ＴＩＭＰ?基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑?１?（?ＴＩＭＰ??ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?１，ＴＩＭＰ１）（表?３）。此外，通過?ＭＣＯＤＥ?對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行??模塊分析，篩選打分值最高的前３個(gè)模塊作為該網(wǎng)絡(luò)的核心聚類模塊（圖４Ｂ，４Ｃ，４Ｄ）。??本研究發(fā)現(xiàn)，除了?ＣＸＣＬ８之外其余９個(gè)潛在核心基因都出現(xiàn)在這３個(gè)核心聚類模塊中，??這意味著這３個(gè)模塊在很大程度上代表了該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵生物特征，同時(shí)這９個(gè)??基因被確認(rèn)為該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心基因（圖５）。??ＧＯ富集分析顯示，模塊１與有絲分裂核分裂、細(xì)胞分裂、有絲分裂胞質(zhì)分裂、中??間體、中心體、細(xì)胞核密切相關(guān)；模塊２與膠原分解代謝過程、膠原纖維組織、細(xì)胞外??基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、血小板衍生生長因子結(jié)合、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、膠原三聚體密切相關(guān)；模塊３與??細(xì)胞外基質(zhì)分解、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間密切相關(guān)（圖６Ａ）。ＫＥＧＧ通路富集分析顯??示，模塊１中的基因顯著富集在Ｐ５３信號(hào)通路、細(xì)胞周期、ＦｏｘＯ信號(hào)通路；模塊２中??的基因顯著富集在ＥＣＭ－受體相互作用、粘著斑、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ信號(hào)通路；模塊３中的基因??顯著富集在Ｔｏｌｌ樣受體信號(hào)通路、ＴＮＦ信號(hào)通路（圖６Ｂ）。本研究的數(shù)據(jù)顯示，某些差??異基因的過表達(dá)可能會(huì)影響它們所參與的信號(hào)通路中的正常調(diào)控。例如，胃癌組織中過??表達(dá)的Ｃ０Ｌ１Ａ２、Ｃ０Ｌ１Ａ１、Ｃ０Ｌ４Ａ１可能會(huì)導(dǎo)致ＥＣＭ－受體相互作用、粘著斑、ＰＩ３Ｋ－??Ａｋｔ信號(hào)通路的失調(diào)，而ＳＰＰ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９的過表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致Ｔｏｌｌ樣受體信號(hào)??通路的失調(diào)。此外

本文編號(hào)：2865362