肝纖維化是慢性肝損傷所致的病理改變,是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段,可嚴(yán)重影響肝臟功能,產(chǎn)生多種并發(fā)癥,甚至危及生命。肝纖維化的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Extracellular matrix protein,ECM)過度積累,而具有纖維化和增殖性的活化狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞是ECM的主要來源,因此抑制肝星狀細(xì)胞活化是治療肝纖維化的重要策略之一。扶正化瘀方是由上海中醫(yī)藥大學(xué)針對肝纖維化血瘀研制,該復(fù)方由丹參、桃仁、五味子、冬蟲夏草、絞股藍(lán)、松花粉六味藥材組成,丹參在方中活血祛瘀作為君藥;冬蟲夏草補(bǔ)虛損、益精氣,桃仁助丹參活血祛瘀,共為臣藥;松花粉益氣潤燥,絞股藍(lán)清熱解毒,共為佐藥;五味子味酸,為引經(jīng)使藥。諸藥合用,活血化瘀,益精養(yǎng)肝,從而達(dá)到抗肝纖維化的效果。目前對于扶正化瘀方化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和抗肝纖維化的作用機(jī)制研究尚不全面。而以整體性、系統(tǒng)性為特點的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),注重從整體出發(fā)探索藥物與疾病之間的關(guān)系,這與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治、方劑配伍的原則不謀而合。因此本課題以扶正化瘀方化學(xué)物質(zhì)組研究為基礎(chǔ),運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與多種組學(xué)結(jié)合的方法初步探討扶正化瘀方抗肝纖維化的作用機(jī)制。本文研究內(nèi)容主要分為以下三個部分:1、扶正化瘀方體內(nèi)外化學(xué)成分的快速鑒別采用UHPLC-Q-TOF/MS方法快速鑒別扶正化瘀方的體內(nèi)外化學(xué)成分。正、負(fù)離子模式下采集的質(zhì)譜信息,并建立扶正化瘀方化學(xué)成分庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,在扶正化瘀方中共鑒別到153種體外化學(xué)成分和49種體內(nèi)化學(xué)成分,為下一步運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討扶正化瘀方中抗肝纖維化的有效成分及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。2、聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法探討扶正化瘀方抑制肝星狀細(xì)胞活化的活性成分及作用機(jī)制基于扶正化瘀方的體內(nèi)外化學(xué)物質(zhì)組,采用文本挖掘的方法篩選出復(fù)方的潛在活性成分。然后,聯(lián)合相似性匹配和分子對接的方法,從扶正化瘀方中篩選出抗肝纖維化的40個有效成分和79種潛在靶標(biāo)。為了提高靶標(biāo)鑒別的準(zhǔn)確性,我們聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建了“成分-靶標(biāo)-差異基因蛋白”網(wǎng)絡(luò),將79種潛在靶標(biāo)減少至31種。對靶蛋白的富集分析結(jié)果表明:扶正化瘀方可能主要通過調(diào)節(jié)HIF-1、PI3KAkt、FoxO和趨化因子等信號通路抑制肝星狀細(xì)胞活性,從而具有治療肝纖維化的作用。最后,我們采用CCK8法對扶正化瘀方中的15個潛在活性成分抑制肝星狀細(xì)胞活化的活力進(jìn)行了檢測,實驗結(jié)果表明二氫丹參酮Ⅰ、五味子酯甲、五味子乙素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹參酮II-A、蟲草素和山奈酚可以顯著地降低肝星狀細(xì)胞(大鼠肝星狀細(xì)胞系-T6細(xì)胞和人肝星狀細(xì)胞系-LX-2細(xì)胞)的活性,進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化作用,其中二氫丹參酮Ⅰ的抑制活力最強(qiáng)(T6細(xì)胞IC50=5.6μM;LX-2細(xì)胞IC50=14.4μM)。在篩選得到的31個潛在靶蛋白中,我們選擇過氧化物酶體增殖物激活劑受體γ(Peroxisome proliferative activated receptorγ,PPARG)進(jìn)行了細(xì)胞水平和分子水平的實驗驗證。結(jié)果表明,五味子乙素、丹酚酸A和山奈酚可直接與PPARG結(jié)合,降低肝星狀細(xì)胞(T6細(xì)胞和LX-2細(xì)胞)的活力,發(fā)揮抗纖維化作用。3、基于“蛋白-代謝物相互作用”策略研究二氫丹參酮Ⅰ抑制肝星狀細(xì)胞活化的網(wǎng)絡(luò)多靶標(biāo)作用機(jī)制基于上述研究,我們采用文本挖掘、相似性匹配和分子對接等網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法識別了182個二氫丹參酮Ⅰ抗肝纖維化的潛在靶標(biāo),為了更準(zhǔn)確的定位其靶蛋白,我們進(jìn)一步結(jié)合代謝組學(xué)數(shù)據(jù),構(gòu)建了“二氫丹參酮Ⅰ-肝纖維化相關(guān)蛋白-代謝物相關(guān)蛋白-代謝物”網(wǎng)絡(luò),經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析后篩選出二氫丹參酮Ⅰ最相關(guān)的靶標(biāo)STAT3和P53。最后,通過體內(nèi)外實驗,具體為流式細(xì)胞儀、表面等離子共振(Surface plasmon resonance,SPR)分析、免疫印跡實驗(Western blotting)、代謝組學(xué)實驗以及硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠實驗對二氫丹參酮Ⅰ與STAT3和P53之間的相互作用和效應(yīng)進(jìn)行了驗證,實驗結(jié)果表明二氫丹參酮Ⅰ通過靶向STAT3和P53抑制肝星狀細(xì)胞活化,進(jìn)而緩解肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

海軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文（二）UHPLC-Q-TOF/MS 對扶正化瘀膠囊體外化學(xué)成分的鑒別精密吸取扶正化瘀膠囊供試品溶液和對照品混合溶液 200 μL于進(jìn)樣小瓶，按照上述色譜和質(zhì)譜的測試條件進(jìn)行樣品分析，得到扶正化瘀方樣品溶液正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，如圖 2-1所示。

丹參酮ⅡA、二氫丹參酮 I在扶正化瘀膠囊供試品和對照品混合溶液正離子模式下提取離子流圖如圖 2-2B、圖2-2D 和圖 2-2C、圖 2-2E。2、化合物鑒別以正離子模式下 4號峰丹參酮ⅡA為例介紹扶正化瘀膠囊中色譜峰的鑒別過程。TIC 圖中的保留時間為 8.751 min（圖 2-2B）的色譜峰顯示的準(zhǔn)分子離子為295.1362，利用 Qualiative Analysis 軟件分析工具計算精確質(zhì)量數(shù)的可能的元素組成(<5 ppm)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已知化合物的質(zhì)荷比，初步確定分子式為 C19H18O3。通過計算該準(zhǔn)分子離子的核素分布情況，從圖 2-3A可以看出同位素分布的理論值與實際值恰好吻合，確定此峰為丹參酮ⅡA。同理可得該模式下 2號峰二氫丹參酮 I的解析過程，如圖 2-3B。

1. 丹酚酸 B；2. 二氫丹參酮 I；3. 丹酚酸 A；4. 丹參酮ⅡA；5. 苦杏仁苷；6. 蟲草素；7. 五味子醇甲；8.五味子乙素；9. 五味子酯甲；10. 山柰酚Figure 2-2 Total ion current map and extracted ion flow diagram of the solution ofFuzheng Huayu Capsule and control sampleA. Total ion chromatogram in positive ion mode of mixed solution of reference substanceB. Ion flow diagram of tanshinone IIA extracted from test solution of Fuzheng HuayuCapsule; C. Ion flow diagram of tanshinone IIA extracted from mixed solution of referencsubstance; D. Ion flow diagram of dihydrotanshinone I extracted from the solution ofHuayu Capsule; E. Ion flow diagram of dihydrotanshinone I extracted from the mixedsolution of reference substance1. salvianolic acid B; 2. dihydrotanshinone I; 3. salvianolic acid A; 4. tanshinone IIA; 5.amygdalin; 6. cordycepin; 7. schisandrin; 8. Schisandrin B;9. schisantherinA;10.kaempferol
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本文編號：2865335