目的:研究柚皮素(NAR)對脂多糖(LPS)誘導的神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護作用方法:在體實驗中,SD大鼠隨機分為5個組(n=6),包括空白組,NAR(100mg/kg)組,LPS(5μg)組,LPS+NAR(50 mg/kg)組和LPS+NAR(100 mg/kg)組。單側(cè)中腦黑質(zhì)注射LPS(5μg)誘導DA神經(jīng)元損傷模型。造模后大鼠連續(xù)灌胃給藥7天,轉(zhuǎn)棒實驗檢測大鼠的運動能力,免疫熒光和Western Blot實驗檢測TH,IBA-1,NLRP3和caspase-1蛋白變化。離體實驗中,BV-2小膠質(zhì)細胞,隨機分為5個組,空白組,NAR(100μM)組,LPS(1μg/ml)組,LPS+NAR(10μM)組,LPS+NAR(100μM)組。NAR預處理1 h后加入LPS誘導小膠質(zhì)細胞的激活。24 h后,Griess試劑盒和ELISA試劑盒檢測細胞上清中炎癥因子(NO,IL-1β和IL-18)的釋放,免疫熒光和Western Blot實驗檢測IBA-1、NLRP3和caspase-1蛋白變化。使用si RNA NLRP3轉(zhuǎn)染技術,檢測NLRP3蛋白的沉默率后,觀察柚皮素對于LPS誘導的BV-2細胞激活的影響。BV-2和MN9D細胞共培養(yǎng)實驗,將BV-2細胞和MN9D細胞均分為10個組,NAR預處理1 h后加入LPS誘導BV-2細胞的激活。24 h后,轉(zhuǎn)移BV-2上清至MN9D細胞中,繼續(xù)培養(yǎng),24 h后,MTT方法檢測MN9D細胞的活性,Western Blot實驗檢測MN9D細胞的TH蛋白變化。結(jié)果:在體實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)棒實驗中,模型組大鼠在棒時間比空白組減少,給予高劑量(100 mg/kg)柚皮素,大鼠在棒時間顯著增加;免疫熒光和Western Blot結(jié)果顯示,模型組DA神經(jīng)元數(shù)量減少,小膠質(zhì)細胞激活,NLRP3炎癥小體表達增加,給予高劑量(100 mg/kg)柚皮素,DA神經(jīng)元數(shù)量增加,小膠質(zhì)細胞激活減少,NLRP3炎癥小體表達減少。離體實驗結(jié)果顯示:與空白組比較,LPS可以引起B(yǎng)V-2細胞上清中炎癥因子(NO、IL-1β和IL-18)的釋放增加,IBA-1蛋白表達增加,NLRP3炎癥小體表達增加,給予高劑量(100μM)柚皮素,上清中炎癥因子釋放減少,IBA-1蛋白表達減少,NLRP3炎癥小體表達增加減少。并且si RNA NLRP3轉(zhuǎn)染后,柚皮素對于BV-2細胞的調(diào)節(jié)作用消失。BV-2和MN9D細胞共培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示:LPS刺激的BV-2細胞上清可以引起MN9D細胞的損傷,TH蛋白表達降低,給予高劑量(100μM)柚皮素,MN9D細胞的活性增加,TH蛋白表達增加。并且在si RNA NLRP3轉(zhuǎn)染后,柚皮素對MN9D細胞的保護作用消失。結(jié)論:在本實驗中,柚皮素可以通過抑制小膠質(zhì)細胞中NLRP3炎癥小體的激活,對LPS誘導的多巴胺能神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護作用。
【學位單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1 柚皮素減輕 LPS 對 DA 神經(jīng)元的損傷。A.大鼠轉(zhuǎn)棒實驗時間統(tǒng)計；B.大鼠中腦免疫熒光雙標檢測；C.大鼠中腦 DA 神經(jīng)元數(shù)量；D.WesternBlot 檢測大鼠中腦 TH 蛋白表達。（ x± SEM, n = 6），與空白組相比，*P < 0.05；與模型組相比，#P < 0.05。Fig.1 NAR attenuated LPS-induced DA neuronal loss in vivo. (A). The time rat stayed on the rodwas recorded. (B). DA neuronal counting by double-immunofluorescence staining with an anti-THantibody（blue）and anti-OX-42 antibody (red). (C). The number of SN TH-positive neurons wascounted and TH protein expression was detected by western blot assay (D). Data were expressed asa percentage of the control group and were the mean ±SEM from six rats. *P < 0.05 compared withcontrol group; #P < 0.05 compared with LPS group.2.2 柚皮素抑制小膠質(zhì)細胞中 NLRP3 炎癥小體的激活在 SD 大鼠實驗中，進一步驗證柚皮素對于 LPS 誘導的小膠質(zhì)細胞激活及NLRP3 的影響。大鼠中腦免疫熒光雙標結(jié)果顯示：紅色熒光代表小膠質(zhì)細胞蛋白（OX-42），綠色熒光代表 NLRP3 蛋白，從光密度測定的結(jié)果可以看出：與空

BC圖2 柚皮素抑制小膠質(zhì)細胞中NLRP3炎癥小體的激活。A.OX-42和NLRP3免疫熒光雙標；B. OX-42 和 NLRP3 的光密度檢測；C.Western Blot 檢測大鼠中腦 IBA-1、NLRP3 和 caspase-050100150200250*#LPS - - + + +NAR (mg/kg)

與模型組比較，給予高劑量（100μM）柚皮素，NLRP3 和 caspase-1 蛋白表達降低（圖4B）。A B圖 4 柚皮素抑制 LPS 誘導的 NLRP3 炎癥小體的激活。A.免疫熒光檢測 NLRP3 蛋白；B.Western Blot 檢測 NLRP3、caspase-1 蛋白表達。（ x±SEM,n=3）, 與空白組相比，*P<0.05；
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