目的:基于腸道菌群變化調(diào)節(jié)TLRs/NF-κB信號通路的機制,探討烏梅丸對2型糖尿病模型大鼠血糖、胰島素及炎性因子等的調(diào)控作用。方法:以60只健康清潔雄性SD大鼠為實驗對象。按隨機原則抽選10只作為正常組,其余50只給予高糖高脂乳劑飼養(yǎng)8周,小劑量腹腔注射STZ(35 mg/kg)建立T2DM模型,血糖大于11.10 mmol/L即為造模成功,將造模成功大鼠隨機分為五組,即模型組、二甲雙胍組(ig200 mg/kg)、烏梅丸高劑量組(ig20 g/kg)、烏梅丸中劑量組(ig10 g/kg)、烏梅丸低劑量組(ig5 g/kg),每組10只。用藥四周后處理大鼠,股動脈取血離心備用,取糞便、結(jié)腸組織待檢。定期監(jiān)測各組大鼠體重及血糖值;提取大鼠糞便DNA采用16S-rDNA對其進(jìn)行基因測序分析大鼠腸道微生物多樣性;取大鼠結(jié)腸組織使用蛋白免疫印記法檢測TLR-4和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測大鼠血清胰島素、LPS、TNF-α、IL-10的表達(dá);取大鼠胰腺采用HE染色觀察其形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果:1.大鼠一般觀察及體重監(jiān)測:正常組大鼠精神活躍,活動正常,毛色潔白光亮,飲食飲水正常,體重呈穩(wěn)態(tài)上升;高糖高脂乳劑飲食大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃,體重增長明顯高于正常組(P0.01);注射STZ后,大鼠多飲多食多尿癥狀明顯,體重減輕(P0.01);用藥四周后,烏梅丸組各劑量組及二甲雙胍組大鼠多飲多食多尿癥狀逐漸緩解,體重下降趨勢較模型組趨緩,體重明顯高于模型組。2.血糖及胰島素檢測結(jié)果:造模前大鼠空腹血糖均屬于正常范圍,造模后大鼠血糖明顯升高(P0.01);用藥后二甲雙胍組、烏梅丸各劑量組血糖均明顯低于模型組(P0.05或P0.01)。用藥四周檢測血清胰島素結(jié)果示:與正常組比較,模型組大鼠INS水平明顯降低,烏梅丸各劑量組及二甲雙胍組INS水平較模型組均升高(P0.01)。3.腸道菌群結(jié)構(gòu)變化結(jié)果:3.1物種分析結(jié)果:正常組特有的OTU數(shù)目大于模型組,烏梅丸中、低劑量組與正常組OTU相似度高于模型組與正常組;模型組擬桿菌門數(shù)量較正常組增加,與模型組比較,烏梅丸高、中、低劑量組擬桿菌門數(shù)量均減少;與正常組比較,模型組厚壁菌門數(shù)量減少,與模型組比較,烏梅丸高、中劑量組厚壁菌門增加;模型組與正常組比較,模型組變形菌門豐度減少,與模型組比較,烏梅丸高、低劑量組變形菌門豐度增加,二甲雙胍組、烏梅丸中劑量組變形菌門較模型組數(shù)量減少。模型組和烏梅丸高劑量組檢測樣品中未有TM7菌門出現(xiàn),正常組、二甲雙胍組、烏梅丸中、低劑量組均檢測出TM7菌門。3.2 Alpha多樣性(Alpha diversity)檢測結(jié)果:sobs指數(shù)結(jié)果:正常組、烏梅丸低劑量組與二甲雙胍組sobs指數(shù)明顯高于模型組(P0.05),烏梅丸中劑量組sobs指數(shù)有升高趨勢,但烏梅丸高劑量組明顯減少。chao指數(shù)結(jié)果:模型組相比于正常組chao指數(shù)減少,與模型組比較,二甲雙胍組與烏梅丸低劑量組明顯增加(P0.01)。ace指數(shù)結(jié)果:模型組ace指數(shù)顯著少于正常組(P0.05),二甲雙胍組及烏梅丸中、低劑量組增加。shannon指數(shù)結(jié)果:各組組間無明顯差異。4.結(jié)腸組織中TLR-4、NF-κB p65的蛋白檢測結(jié)果:與正常組比較,模型組TLR-4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量均明顯上升,有顯著性差異(P0.01);與模型組比較,烏梅丸高、中、低組及二甲雙胍組TLR-4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量均明顯下降,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01或P0.05)。5.血清中大鼠LPS、TNF-α、IL-10表達(dá)的ELISA檢測結(jié)果:與正常組比較,模型組血清LPS、TNF-α水平明顯上升(P0.01);與模型組比較,烏梅丸高、中、低各劑量組血清LPS、TNF-α水平表達(dá)量明顯下降(P0.01)。與正常組比較,模型組血清IL-10水平明顯減少(P0.01);與模型組比較,烏梅丸中劑量組血清IL-10水平表達(dá)量明顯上升(P0.01),烏梅丸低劑量組、二甲雙胍組IL-10水平增加(P0.05)。6.胰腺組織病理改變:正常大鼠的胰腺HE染色結(jié)果可見其中胰島的數(shù)量豐富,形狀有規(guī)則,胰島細(xì)胞的界限清晰,2型糖尿病大鼠的胰島數(shù)量減少,形狀不規(guī)則,邊緣不整齊等病理學(xué)改變;烏梅丸高、中劑量組和二甲雙胍組改善明顯。結(jié)論:烏梅丸各劑量組對2型糖尿病模型大鼠的行為、體重和空腹血糖、胰島素水平均產(chǎn)生明顯的恢復(fù)作用,并且可以改善胰腺病理損傷,烏梅丸可能是通過對腸道菌群多樣性與物種豐度的調(diào)節(jié)作用,而起到降低模型鼠LPS水平,降低NF-κB p65及TLR-4蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制炎性因子TNF-α,促進(jìn)抗炎因子IL-10的生成,控制慢性低度性炎癥的發(fā)生,從而達(dá)到防治2型糖尿病的目的。
【學(xué)位單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

11流程如圖1。圖1 測序總工作流程圖Figure1 Sequencing total work flow chart2.7 結(jié)腸組織 NF-κB p65、TLR-4 蛋白表達(dá)檢測2.7.1 結(jié)腸組織的提取：2型糖尿病模型大鼠灌胃烏梅丸四周后，禁食不禁水12 h，使用水合氯醛進(jìn)行麻醉，大鼠生理反應(yīng)消失后，在冰上操作，剪開大鼠腹部取結(jié)腸組織，結(jié)腸組織位于盲腸下部，在滅菌低溫生理鹽水中清洗結(jié)腸組織后，仔細(xì)分裝，做好標(biāo)記，放置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.7.2 結(jié)腸組織蛋白的提�。悍Q取結(jié)腸組織100 mg于EP管內(nèi)，無菌操作盡量剪成細(xì)小碎片，全程在冰上操作，保持低溫以防蛋白降解。按照蛋白提取量預(yù)估好組織裂解液的用量

圖 6 烏梅丸不同劑量對 T2DM 大鼠體重的影響Figure6 Effects of Wumei Wan on body weight of T2DM rats3.1.2 各組大鼠空腹血糖及胰島素變化

烏梅丸不同劑量對T2DM大鼠胰島素的影響
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