1目的1.1觀察不同濃度固本增骨膠囊含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化的效應(yīng),細(xì)胞內(nèi)分布和細(xì)胞生物學(xué)行為;檢測(cè)固本增骨膠囊含藥血清成骨相關(guān)蛋白的表達(dá),及BMPs信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá);探討固本增骨膠囊治療OP的機(jī)制。1.2為固本增骨膠囊的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2方法2.1培養(yǎng)大鼠BMSCs并傳代,制備不同濃度的固本增骨膠囊含藥血清(5%、10%、20%、30%),設(shè)置對(duì)照組,給藥后以MTT法測(cè)大鼠BMSCs增殖率;采用堿性磷酸酶染色觀察BMSCs的成骨分化情況;2.2采用ELISA技術(shù)檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白:一型膠原蛋白、堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白的濃度。探討固本增骨膠囊含藥血清對(duì)大鼠BMSCs成骨分化的影響。2.3采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)成骨相關(guān)的BMPs信號(hào)通路中BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的基因表達(dá)水平,探討B(tài)MPs信號(hào)的激活情況,探討固本增骨膠囊含藥血清影響成骨分化的作用機(jī)制。3結(jié)果3.1 Wistar大鼠BMSCs的傳代培養(yǎng)成功。3.2 MTT法測(cè)量細(xì)胞增值率:不同時(shí)點(diǎn)組間MTT比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),從時(shí)點(diǎn)維度看,96h、120hMTT均與24h、48h、72hMTT差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且前者均高于后者;從干預(yù)措施維度看,10%、20%、30%含藥血清組MTT與其余組別比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),前者M(jìn)TT均高于后者,且以20%含藥血清組為最高,其余組別間MTT比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示20%含藥血清組效果最佳。詳細(xì)結(jié)果見表1、圖2。3.3堿性磷酸酶染色觀察:堿性磷酸酶染色后可見不同固本增骨膠囊含藥血清組及傳統(tǒng)誘導(dǎo)組細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)紫色細(xì)胞聚集區(qū)。含藥血清組(5%、10%、20%)隨著濃度增加,藍(lán)紫色區(qū)域逐漸密集,當(dāng)濃度達(dá)到20%時(shí),染色區(qū)域最為密集,顯著高于空白組與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組,當(dāng)濃度增加到30%時(shí),染色區(qū)域減少。提示隨著藥物濃度的增加,BMSCs成骨分化程度升高,20%濃度時(shí)成骨分化效果最佳。詳細(xì)結(jié)果見圖33.4成骨相關(guān)蛋白檢測(cè):5%、10%、20%含藥血清組骨鈣蛋白、骨橋蛋白、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白與其他各組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且5%、10%、20%含藥血清組蛋白濃度均高于其他組,而30%含藥血清組、空白組、傳統(tǒng)誘導(dǎo)組蛋白濃度無明顯差異。其中以20%含藥血清組蛋白濃度最高,提示20%含藥血清組效果最佳,詳細(xì)結(jié)果見表2-5、圖4-7。3.5 BMP信號(hào)通路相關(guān)基因檢測(cè):Real-time PCR結(jié)果顯示,10%、20%、30%含藥血清組BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2基因表達(dá)水平與其他各組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且10%、20%、30%含藥血清組BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2均高于其余各組,而30%含藥血清組、空白組、傳統(tǒng)誘導(dǎo)組相關(guān)基因表達(dá)水平無明顯差異。其中20%含藥血清組基因表達(dá)水平為最高,提示20%含藥血清組效果最佳,詳細(xì)結(jié)果見表6-9、圖8-11。4結(jié)論4.1固本增骨膠囊含藥血清能明顯促進(jìn)大鼠BMSCs的成骨分化能力;4.2固本增骨膠囊含藥血清能提高骨鈣蛋白、骨橋蛋白、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白的濃度;4.3固本增骨膠囊含藥血清能明顯上調(diào)BMP信號(hào)通路BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的mRNA的表達(dá),促進(jìn)骨形成。
【學(xué)位單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 2 組間 MTT 法 OD 值比較實(shí)驗(yàn)三 成骨分化染色方法據(jù)96孔板中所加入的相應(yīng)培養(yǎng)基，分組同前，依次為：空白血清組、傳統(tǒng)5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組。將增骨膠囊含藥血清組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)2周后分別取出各自1塊細(xì)胞爬片，每孔加入2mL4%中性甲醛溶液，固定30min。吸走甲醛溶液，PBS清洗2次定10分鐘，加入底物，37℃水浴30min，水洗，再加入蘇木素復(fù)染10分鐘次后晾干，將培養(yǎng)板置于鏡下觀察。學(xué)方法研究收集所得數(shù)據(jù)均采用 SPSS20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其中服從正態(tài)或近似量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差，即（ x s）表示，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)組間比較采用單，重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組內(nèi)多重比較方差齊

不同濃度固本增骨膠囊含藥血清堿性磷酸酶染色

圖 4 組間骨鈣蛋白比較間骨橋蛋白比較 5%、10%、20%含藥血清組骨橋蛋白與其他各組比較差學(xué)意義（P<0.05），且 5%、10%、20%含藥血清組骨橋蛋白均高于其余各20%含藥血清組骨橋蛋白為最高，提示 20%含藥血清組效果最佳，詳細(xì)結(jié)果見表 3 組間骨橋蛋白比較（ x s）組別 骨橋蛋白（μg/L） F P5%含藥血清組 16.551±3.09441.326 <0.00110%含藥血清組 18.405±2.14920%含藥血清組 21.773±8.06430%含藥血清組 1.648±0.725abc空白組 1.645±0.277abc
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2862604