1目的1.1觀察不同濃度固本增骨膠囊含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化的效應,細胞內(nèi)分布和細胞生物學行為;檢測固本增骨膠囊含藥血清成骨相關(guān)蛋白的表達,及BMPs信號通路相關(guān)基因的表達;探討固本增骨膠囊治療OP的機制。1.2為固本增骨膠囊的臨床應用提供實驗依據(jù)。2方法2.1培養(yǎng)大鼠BMSCs并傳代,制備不同濃度的固本增骨膠囊含藥血清(5%、10%、20%、30%),設置對照組,給藥后以MTT法測大鼠BMSCs增殖率;采用堿性磷酸酶染色觀察BMSCs的成骨分化情況;2.2采用ELISA技術(shù)檢測成骨相關(guān)蛋白:一型膠原蛋白、堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白的濃度。探討固本增骨膠囊含藥血清對大鼠BMSCs成骨分化的影響。2.3采用Real-time PCR技術(shù)檢測成骨相關(guān)的BMPs信號通路中BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的基因表達水平,探討B(tài)MPs信號的激活情況,探討固本增骨膠囊含藥血清影響成骨分化的作用機制。3結(jié)果3.1 Wistar大鼠BMSCs的傳代培養(yǎng)成功。3.2 MTT法測量細胞增值率:不同時點組間MTT比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),從時點維度看,96h、120hMTT均與24h、48h、72hMTT差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),且前者均高于后者;從干預措施維度看,10%、20%、30%含藥血清組MTT與其余組別比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),前者MTT均高于后者,且以20%含藥血清組為最高,其余組別間MTT比較差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05),其余組間均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),提示20%含藥血清組效果最佳。詳細結(jié)果見表1、圖2。3.3堿性磷酸酶染色觀察:堿性磷酸酶染色后可見不同固本增骨膠囊含藥血清組及傳統(tǒng)誘導組細胞呈現(xiàn)藍紫色細胞聚集區(qū)。含藥血清組(5%、10%、20%)隨著濃度增加,藍紫色區(qū)域逐漸密集,當濃度達到20%時,染色區(qū)域最為密集,顯著高于空白組與傳統(tǒng)成骨誘導組,當濃度增加到30%時,染色區(qū)域減少。提示隨著藥物濃度的增加,BMSCs成骨分化程度升高,20%濃度時成骨分化效果最佳。詳細結(jié)果見圖33.4成骨相關(guān)蛋白檢測:5%、10%、20%含藥血清組骨鈣蛋白、骨橋蛋白、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白與其他各組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),且5%、10%、20%含藥血清組蛋白濃度均高于其他組,而30%含藥血清組、空白組、傳統(tǒng)誘導組蛋白濃度無明顯差異。其中以20%含藥血清組蛋白濃度最高,提示20%含藥血清組效果最佳,詳細結(jié)果見表2-5、圖4-7。3.5 BMP信號通路相關(guān)基因檢測:Real-time PCR結(jié)果顯示,10%、20%、30%含藥血清組BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2基因表達水平與其他各組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),且10%、20%、30%含藥血清組BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2均高于其余各組,而30%含藥血清組、空白組、傳統(tǒng)誘導組相關(guān)基因表達水平無明顯差異。其中20%含藥血清組基因表達水平為最高,提示20%含藥血清組效果最佳,詳細結(jié)果見表6-9、圖8-11。4結(jié)論4.1固本增骨膠囊含藥血清能明顯促進大鼠BMSCs的成骨分化能力;4.2固本增骨膠囊含藥血清能提高骨鈣蛋白、骨橋蛋白、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白的濃度;4.3固本增骨膠囊含藥血清能明顯上調(diào)BMP信號通路BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的mRNA的表達,促進骨形成。
【學位單位】：甘肅中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 2 組間 MTT 法 OD 值比較實驗三 成骨分化染色方法據(jù)96孔板中所加入的相應培養(yǎng)基，分組同前，依次為：空白血清組、傳統(tǒng)5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組。將增骨膠囊含藥血清組和對照組細胞培養(yǎng)2周后分別取出各自1塊細胞爬片，每孔加入2mL4%中性甲醛溶液，固定30min。吸走甲醛溶液，PBS清洗2次定10分鐘，加入底物，37℃水浴30min，水洗，再加入蘇木素復染10分鐘次后晾干，將培養(yǎng)板置于鏡下觀察。學方法研究收集所得數(shù)據(jù)均采用 SPSS20.0 進行數(shù)據(jù)處理，其中服從正態(tài)或近似量資料以均值±標準差，即（ x s）表示，完全隨機設計組間比較采用單，重復測量設計組間比較采用重復測量方差分析，組內(nèi)多重比較方差齊

不同濃度固本增骨膠囊含藥血清堿性磷酸酶染色

圖 4 組間骨鈣蛋白比較間骨橋蛋白比較 5%、10%、20%含藥血清組骨橋蛋白與其他各組比較差學意義（P<0.05），且 5%、10%、20%含藥血清組骨橋蛋白均高于其余各20%含藥血清組骨橋蛋白為最高，提示 20%含藥血清組效果最佳，詳細結(jié)果見表 3 組間骨橋蛋白比較（ x s）組別 骨橋蛋白（μg/L） F P5%含藥血清組 16.551±3.09441.326 <0.00110%含藥血清組 18.405±2.14920%含藥血清組 21.773±8.06430%含藥血清組 1.648±0.725abc空白組 1.645±0.277abc
【參考文獻】

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本文編號：2862604