目的:本課題采用分子生物學(xué)技術(shù)從氣道上皮細(xì)胞自噬水平角度探討清金化痰湯對AECOPD大鼠的影響,觀察清金化痰湯干預(yù)后AECOPD大鼠氣道上皮細(xì)胞后自噬相關(guān)Beclin-1、LC3蛋白及m RNA表達(dá)的變化與炎癥情況,以明確其作用靶點(diǎn)。從而闡述AECOPD大鼠氣道上皮細(xì)胞自噬與細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的關(guān)系。從細(xì)胞分子層次為清金化痰湯對AECOPD防治的機(jī)制提供客觀依據(jù)。方法:將健康雄性SPF級SD大鼠120只,體重180~220g,隨機(jī)抽取其中60只制作含藥血清,50只采用煙熏染毒+LPS(脂多糖)聯(lián)合經(jīng)典制備方法進(jìn)行造模,10只作為空白對照。藥物血清按照隨機(jī)數(shù)字法分為6組(清金化痰湯高劑量組30 g/kg·d;清金化痰湯中劑量組15g/kg·d,清金化痰湯低劑量組7.5 g/kg·d,羅紅霉素陽性對照組0.0175g/kg·d,模型組與空白對照組)每組20只。取造模成功后AECOPD大鼠50只與空白對照組10只階段性進(jìn)行氣道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。將制備的清金化痰湯含藥血清按照DMEM-F12與藥物血清10:1比例的培養(yǎng)液對原代培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞分組干預(yù)。HE染色觀察肺組織變化,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測氣道上皮Beclin-1、LC3m RNA的表達(dá)水平。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測氣道上皮細(xì)胞Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)運(yùn)用ELISA檢測其IL-6,IL-8細(xì)胞炎癥因子含量。結(jié)果:1.肺組織病理切片結(jié)果造模后大鼠肺組織病理切片HE染色顯示大鼠支氣管周圍有炎性細(xì)胞浸潤,氣管壁增厚,管腔閉塞、狹窄,肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯,肺泡擴(kuò)張并融合成肺大泡,肺泡腔內(nèi)可見有滲出物。2.免疫熒光鑒定細(xì)胞綠色二抗標(biāo)記的角蛋白表達(dá)陽性綠色熒光;DAPI染核呈現(xiàn)出的藍(lán)色熒光;merge后可見上皮細(xì)胞陽性表達(dá)率達(dá)到99%以上。3.各組細(xì)胞血清干預(yù)后自噬因子Beclin-1、LC3 m RNA表達(dá)水平的變化與正常組比較,模型組大鼠氣道上皮細(xì)胞血清干預(yù)后Beclin-1、LC3均有不同程度升高(P0.01);與模型對照組比較,用藥組大鼠自噬相關(guān)因子Beclin-1、LC3表達(dá)下降約1倍(P0.01),其羅紅霉素陽性對照組與清金化痰湯高劑量組下降明顯,二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.各組大鼠氣道上皮細(xì)胞血清干預(yù)后Beclin-1、LC3-I、LC3-II及LC3-II/I蛋白表達(dá)水平變化與正常組比較,模型組大鼠氣道上皮細(xì)胞血清干預(yù)后Beclin-1、LC3-I、LC3-II及LC3-II/I均有不同程度升高(P0.01);與模型對照組比較,用藥組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)均有下降(P0.05),其中高劑量組蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.01),趨于陽性對照組。5.各組大鼠氣道上皮細(xì)胞血清干預(yù)后炎性因子IL-6、IL-8變化與正常對照組相比,模型組炎性因子IL-6、IL-8均有明顯升高(P0.01);與模型組對照組比較,用藥組氣道上皮細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8有不同程度降低(P0.05),其中清金化痰湯高劑量組趨于陽性對照組,炎癥因子明顯低于模型對照組約1倍(二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05)。結(jié)論:清金化痰湯可明顯減輕AECOPD大鼠氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),對氣道上皮起到保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是通過對氣道上皮細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié),抑制炎癥因子IL-6、IL-8的水平,從而達(dá)到減輕炎癥反應(yīng),發(fā)揮抗炎作用達(dá)到抑制COPD的急性發(fā)作與加重。
【學(xué)位單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

位置備皮清潔消毒之后，行正中小切口，用 10cm m 左右，逐層剝離，直到氣管完全暴露。部位置的鼠板上抬使其和鼠板平面保持 45°，使用氣管進(jìn)行穿刺，通過氣管注射 0.2 mL LPS 。完成立放置并且輕微搖晃大約 2 min ，讓液體在雙肺 3.0 縫合線縫合頸部皮膚，局部消毒，放置于干凈流程均嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。

（1）用 PBS 緩沖液沖洗 2 次，加入 0.25%胰蛋白酶-EDTA 溶液 2 mL，培養(yǎng)箱內(nèi)消化約 4 分鐘。（2）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓或者少量漂浮，如圖 3-E,加細(xì)胞培養(yǎng)液（含 15%FBS、1%雙抗）終止消化，使用一次性吸管多次吹打。（3）把細(xì)胞懸液移至 15 mL 離心管內(nèi)，1000rpm/min 離心 2 分鐘，棄掉上層清液，添加 1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液并重懸細(xì)胞。（4）放入 30 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并注入 2-3 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液并放置于 37℃5% CO2 恒溫孵育箱中培養(yǎng) 3 小時(shí)。（5）回收上清細(xì)胞懸液，即為上皮細(xì)胞，放入新的 30 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并注入 2-3 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液并放在 37℃ 5% CO2 孵育箱里培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每隔一天更換一次培養(yǎng)基，并且查看并記下細(xì)胞的生長狀態(tài)。第2 代細(xì)胞的形態(tài)比較規(guī)則，呈鵝卵石狀，大小比較均勻，見圖 3-F。

圖 3. COPD大鼠氣道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)2.4.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)通常情況下細(xì)胞要具有一定的密度才能夠順利增殖，因此對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。如果待測懸液里的細(xì)胞分布較為均勻，那么統(tǒng)計(jì)固定體積懸液里的細(xì)胞個數(shù)，便能夠計(jì)算得到每毫升懸液里的細(xì)胞個數(shù)。（1）將計(jì)數(shù)板和蓋片擦拭干凈，同時(shí)把蓋片蓋于計(jì)數(shù)板上。（2）取出少量細(xì)胞懸液，滴于蓋片邊緣位置，使懸液將蓋片與計(jì)數(shù)板中間填滿，放置 3min，蓋片的下方位置不能有氣泡，也不可以使懸液流進(jìn)旁邊槽里。（3）算出板中4個格的細(xì)胞總量，壓線細(xì)胞僅統(tǒng)計(jì)左邊以及上方的個數(shù)。
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本文編號：2862592