[研究背景]炎癥是一把雙刃劍,適度的炎癥反應有利于機體對抗外界病原微生物的感染,而失調(diào)的炎癥反應又會使這把利劍揮向機體自身,過度放大或持續(xù)存在的炎癥反應可以導致機體組織損傷和器質性病變。炎性小體是胞漿內(nèi)多種蛋白質組成的復合體,這種復合體能夠剪切活化半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)進而在天然免疫防御的過程中促進炎性細胞因子前體(pro-interleukin-1β,pro-IL-1β)和pro-IL-18 的切割成熟,并引起 caspase-1 依賴的編程性細胞死亡(pyroptosis),即焦亡。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能在體內(nèi)組裝成有功能的炎癥小體主要有核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptor,NLR)家族的 NLRP3(NLR family,pyrin domain containing3)、NLRP1、包含半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶活化和募集結構域蛋白4(NLR family,caspase activation and recruitment domain(CARD)domain containing 4,NLRC4)、AIM2(absent in melanoma 2)等。由于可以被不同類型的激活劑活化,包括病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns.PAMP)或損傷相關的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),如代謝產(chǎn)物,如高血糖、飽和脂肪酸、膽固醇結晶、尿酸結晶等,因此NLRP3炎癥小體是目前研究最為深入和廣泛的一類炎癥小體。NLRP3 炎癥小體是由細胞內(nèi)受體NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)以及 caspase-1 共同組成的高分子量蛋白復合物,具有病原體識別功能,既能感應體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變,也能被多種組織損傷信號激活。NLRP3炎癥小體持續(xù)活化會使促炎因子過度表達,導致慢性炎癥的發(fā)生,如2型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化、痛風及腫瘤等。因此,尋找和發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體抑制劑,是防治相關疾病的一條重要途徑。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚結構的次生代謝物,至今已有超過8000名成員被確認,如來自姜黃的姜黃素(Curcumin,CUR),或綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)等。流行病學研究、體內(nèi)和體外研究、以及臨床試驗結果均建議合理增加多酚攝入,可以降低罹患慢性病的風險,改善人類健康,歸因于其抗氧化,抗炎,抗腫瘤等生物學和藥理學作用。姜黃作為一種常見的東方香料,在亞洲烹飪中經(jīng)常被使用,尤其是印度、巴基斯坦和泰國。姜黃素是姜黃根狀莖的主要成分,是一種多酚類化合物。姜黃素作為抗炎藥物已有很長的使用歷史,體外和體內(nèi)研究均表明,姜黃素能抑制炎癥,并且無明顯毒副作用,被應用于多種炎癥性疾病,包括肥胖、糖尿病、心血管疾病、支氣管哮喘和風濕性關節(jié)炎等。EGCG是綠茶茶多酚的主要成分,是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體,也是研究非常廣泛的多酚類化合物,具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎以及抗腫瘤等作用。盡管如此,對于上述多酚類化合物的生物學作用機制研究并不深入。那么,植物多酚抗炎功能如此廣泛,是否與具有廣泛激活劑的NLRP3炎癥小體有關聯(lián)?我們結果顯示,姜黃素和EGCG均可抑制NLRP3炎癥小體的活化,是發(fā)揮抗炎作用的重要機制。通過細胞實驗及小鼠體內(nèi)實驗,對于姜黃素和EGCG抑制NLRP3炎癥小體活化的信號通路,包括鉀離子外流、活性氧、受損線粒體在細胞內(nèi)的定位、焦亡等機制進行了深入研究。姜黃素和EGCG生物學作用廣泛,為炎癥小體活化的機制研究提供了新的候選分子,并且本研究揭示了姜黃素及EGCG新的抗炎機制,為其在NLRP3炎癥小體參與的疾病中的臨床應用提供了理論基礎。第一部分:姜黃素通過抑制NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用的研究研究目的:通過小鼠骨髓來源的巨噬細胞等細胞實驗,及野生型或Nlrp3-/-小鼠實驗,1.明確姜黃素對NLRP3炎癥小體的抑制作用;2.研究姜黃素抑制NLRP3炎癥小體活化的機制。研究方法:1.炎癥小體的活化小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)或人單核細胞系THP-1常規(guī)培養(yǎng),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及刺激劑,如單鈉尿酸鹽結晶(monosodium urate crystal,MSU),鋁佐劑(Alum),咪喹莫特(Imiquimod,R837)及尼日利亞菌素(Nigericin),誘導NLRP3炎性小體的活化;poly(dA:dT)刺激AIM2炎性小體的活化;鼠傷寒沙門氏菌感染細胞活化NLRC4炎癥小體。2.酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA)測定巨噬細胞培養(yǎng)上清或血清中 IL-1β、IL-18、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF--α)等的含量。3.蛋白質免疫印跡(Western Blot，WB)分析巨噬細胞裂解物中pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC多聚體、NLRP3、actin等蛋白表達;以及培養(yǎng)上清液中pro-caspasel具有活性的片段p20及pro-IL-1β的活化形式IL-1β的分泌。4.乳酸脫氫酶釋放法(lactate dehydrogenase,LDH release assay)測定細胞培養(yǎng)上清中LDH的活性,從而分析姜黃素的細胞毒性及姜黃素對NLRP3-caspase-1通路活化引發(fā)的細胞焦亡影響。5.激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)分析細胞熒光蛋白表達等:5.1 MitoSOX標記線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS),共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,運用圖像處理軟件Image J分析熒光強度,以反映細胞內(nèi)線粒體活性氧的水平;5.2Mitotracker標記線粒體,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,Image J分析熒光強度,以反映細胞內(nèi)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)變化;5.3鉀離子熒光探針Asante Potassium Green 2(APG-2)標記鉀離子,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,Image J分析熒光強度,分析細胞內(nèi)鉀離子濃度變化;5.4以TOM20標記線粒體,tubulin標記細胞微管,Alexa Fluor二抗孵育,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,測定線粒體在細胞內(nèi)的定位和形態(tài);5.5免疫熒光抗體標記ASC,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,計數(shù)ASC斑點形成的個數(shù)。6.NAD/NADH定量試劑盒測定細胞內(nèi)NAD+水平,分析實驗不同組細胞NAD+水平的相對濃度。7.電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma optical emission spectrometry,ICP-OES)測定細胞內(nèi)鉀離子的濃度水平。8.腹腔注射MSU誘導小鼠急性腹膜炎模型,流式細胞術計數(shù)炎性細胞等,明確姜黃素在體內(nèi)對NLRP3通路的抑制作用。9.高脂飲食誘導野生型(widetype,WT)C57BL/6小鼠和N]rp3-/-小鼠的2型糖尿病模型,分析姜黃素對NLRP3通路的抑制作用與其療效的相關性。結果:1.小鼠BMDMs實驗,在LPS啟動NLRP3炎癥小體活化之前,給與姜黃素,WB結果顯示,姜黃素在30-50μM,劑量依賴的抑制pro-IL-1β的表達、caspase-1 的活化和 IL-1β 的分泌;ELISA 結果顯示,IL-1β、IL-18、TNF-α 的分泌(P0.01)。2.在LPS啟動NLRP3炎癥小體第一信號之后,給與姜黃素處理,然后用尼日利亞菌素活化炎癥小體,WB結果顯示,姜黃素在30-50 μM,劑量依賴的抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌,ELISA實驗進一步驗證了上述結果(P0.001),而TNF-α的分泌無影響(p0.05)。3.運用不同類型的刺激劑活化炎癥小體,WB和ELISA發(fā)現(xiàn),姜黃素均下調(diào)了caspase-1的活化和IL-1β的分泌,而姜黃素對于NLRC4、AIM2炎癥小體活化無抑制作用。4.運用THP1細胞的NLRP3炎癥小體活化實驗模型,WB結果顯示,與小鼠骨髓巨噬細胞的實驗結果一致,姜黃素同樣可以抑制人來源的巨噬細胞caspase-1的活化和IL-1β的分泌。5.WB和ELISA結果表明,與姜黃素類似的化合物去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin,DMC),雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin,BDMC)均可以抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌,而姜黃素體內(nèi)代謝的氫化衍生物四氫姜黃素(tetrahydrocurcum in,THC)無明顯抑制作用。COX-2選擇性抑制劑塞來昔布(celecoxib)并不能逆轉姜黃素的抑制作用。6.共聚焦顯微鏡和ICP-OES的結果均顯示,姜黃素抑制尼日利亞菌素或尿酸鹽晶體誘導的NLRP3炎癥小體的活化過程中,細胞內(nèi)的鉀離子外流減少。7.姜黃素在抑制尼日利亞菌素或尿酸鹽晶體誘導的NLRP3炎癥小體活化過程中,檢測ROS、ΔΨm及NAD+等指標,發(fā)現(xiàn)線粒體損傷增加。8.在尼日利亞菌素誘導的NLRP3炎癥小體活化細胞模型中,圖像顯示姜黃素阻止了尼日利亞菌素誘導的受損線粒體到核周區(qū)域的轉運,而這種微管驅動的線粒體空間定位的阻滯過程并不依賴微管乙�；�。9.WB顯示姜黃素減少了 NLRP3炎癥小體組裝過程中ASC二聚體的形成,成像顯示ASC斑點明顯減少。10.姜黃素減輕了尿酸鹽晶體誘導的小鼠腹膜炎模型的炎癥反應,包括血清及腹腔灌洗液中IL-1β的分泌減低,中性粒細胞的數(shù)量減少。11.姜黃素緩解WT小鼠高脂飲食誘導的胰島素抵抗,降低了高脂飲食誘導的炎癥因子,包括IL-1β、IL-18在血清或肝臟組織培養(yǎng)上清中的分泌,而Nlrp3-/-小鼠未呈現(xiàn)緩解作用。結論:1.姜黃素特異性地抑制NLRP3炎癥小體的啟動與組裝活化過程;2.姜黃素通過阻止K+外流及下游線粒體的空間定位、ASC二聚體和斑點的形成,從而抑制NLRP3炎癥小體活化;3.姜黃素可以通過抑制NLRP3炎癥小體活化,緩解尿酸鹽晶體誘導的急性腹膜炎癥及高脂飲食誘導的胰島素抵抗。第二部分:EGCG通過抑制NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用的研究研究目的:通過小鼠骨髓來源的巨噬細胞、人單核細胞的NLRP3炎癥小體活化模型,及高脂飲食誘導的野生型小鼠2型糖尿病模型,1.明確EGCG對NLRP3炎癥小體的抑制作用;2.研究EGCG抑制NLRP3炎癥小體活化的機制。研究方法:1.炎癥小體的活化小鼠BMDMs或THP-1細胞常規(guī)培養(yǎng),LPS及刺激劑,如MSU、Alum、R837及Nigericin,誘導NLRP3炎性小體活化。2.ELISA測定巨噬細胞培養(yǎng)上清或血清中IL-1β、IL-18、TNF-α等的含量。3.WB分析巨噬細胞裂解物中pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC多聚體、NLRP3、actin等蛋白水平表達；以及培養(yǎng)上清液中pro-caspase1具有活性的片段p20及pro-IL-1β的活化形式IL-1β分泌。4..LDH釋放法測定細胞培養(yǎng)上清中LDH的活性,從而分析EGCG的細胞毒性及EGCG對NLRP3-caspase-1通路活化引發(fā)的細胞焦亡的影響。5.激光共聚焦掃描顯微鏡分析細胞熒光蛋白表達等:5.1 MitoSOX標記線粒體ROS,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,運用圖像處理軟件Image J分析熒光強度,以反映細胞內(nèi)線粒體活性氧的水平;5.2 Mitotracker標記線粒體,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,ImageJ分析熒光強度,以反映細胞ΔΨm變化；5.3鉀離子熒光探針APG-2標記鉀離子,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,ImageJ分析熒光強度,分析細胞內(nèi)鉀離子濃度變化;5.4 以TOM20標記線粒體,tubulin標記細胞微管,Alexa Fluor二抗孵育,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,測定線粒體在細胞內(nèi)的定位;5.5免疫熒光抗體標記ASC蛋白,共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像,計數(shù)ASC斑點形成的個數(shù);6.NAD/NADH定量試劑盒測定細胞內(nèi)NAD+水平,分析實驗不同組細胞NAD+的相對濃度。7.建立高脂飲食誘導C57BL/6肥胖小鼠模型,分析EGCG對NLRP3通路在體內(nèi)的抑制作用。結果:1.小鼠BMDMs實驗,在LPS啟動NLRP3炎癥小體活化之前,ELISA結果顯示,EGCG 下調(diào) IL-1β、IL-18、TNF-α 的分泌(P0.01)。2.在LPS啟動NLRP3炎癥小體第一信號之后,給與EGCG處理,然后用尼日利亞菌素活化炎癥小體,WB結果顯示,姜黃素在20-40μM,劑量依賴的抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌,ELISA實驗進一步驗證了上述結果(P0.001),而TNF-α的分泌無影響(p0.05)。3.運用不同類型的刺激劑活化炎癥小體,ELISA發(fā)現(xiàn),EGCG均下調(diào)了IL-1β、IL-18的分泌。4.運用人THP1細胞NLRP3炎癥小體活化實驗模型,ELISA結果顯示,與小鼠BMDMs結果一致,EGCG同樣可以抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌。5.共聚焦顯微鏡和ICP-OES的結果均顯示,EGCG抑制尼日利亞菌素或尿酸鹽晶體誘導的NLRP3炎癥小體的活化過程中,細胞內(nèi)的鉀離子外流無明顯改變。6.EGCG在抑制尼日利亞菌素或尿酸鹽晶體誘導的NLRP3炎癥小體活化過程中,線粒體ROS下調(diào),然而魚藤酮不能逆轉EGCG對NLRP3的抑制作用。并且EGCG進一步降低了線粒體的AΨm及NAD+等,顯示EGCG使線粒體的損傷增加。7.在抑制尼日利亞菌素誘導的NLRP3炎癥小體活化過程中,成像顯示EGCG阻止了尼日利亞菌素誘導的受損線粒體到核周區(qū)域的轉運,而這種微管驅動的線粒體空間定位阻滯過程不依賴微管乙�；�。8.WB顯示EGCG減少了 NLRP3炎癥小體組裝過程中ASC二聚體的形成,成像顯示ASC斑點明顯減少。9.高脂飲食誘導C57BL/6肥胖小鼠中,在同樣條件的刺激劑誘導下嗎,與僅高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠來源的BMDMs細胞比較,給予EGCG及高脂飲食的肥胖小鼠來源的細胞顯示caspase-1活化水平明顯減低,炎性因子IL-1β分泌明顯減少。結論:1.EGCG可抑制NLRP3炎癥小體的啟動與組裝活化過程;2.EGCG通過阻滯受損線粒體的空間定位、減少ASC斑點的形成等機制,抑制NLRP3炎癥小體活化;3.EGCG可降低肥胖小鼠NLRP3炎癥小體活化水平。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖２．姜黃素抑制炎癥小體活化的第二信號。??姜黃素處理ＬＰＳ誘導的ＢＭＤＭ細胞１小時，然后用ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ刺激活化ＮＬＲＰ３??炎癥小體。（Ａ）免疫印跡分析培養(yǎng)基上清液和細胞提取物的ｃａｓｐａｓｅ－１活化和ＩＬ－１Ｐ??分泌；（Ｂ）免疫印跡分析培養(yǎng)基細胞提取蛋白中，ＮＬＲＰ３組裝原件ＡＳＣ、ＮＬＲＰ３??

圖３．姜黃素抑制不同刺激劑誘導的小鼠ＮＬＲＰ３炎性小體活化。??姜黃素（４〇ｎＭ）處理ＬＰＳ誘導的ＢＭＤＭｓ?１小時，然后用Ｒ８３７、ＭＳＵ、Ａｌｕｍ??和ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ進行刺激活化ＮＬＲＰ３炎癥小體。（Ａ）運用免疫印跡法分析培養(yǎng)基上清??液和細胞提取物中的ｃａｓａｓｅ－１；－ａｃｔｉｎ。Ｐ－－

圖４．姜黃素抑制人單核細胞中的ＮＬＲＰ３炎性體活化。??姜黃素處理后用ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ刺激ＰＭＡ分化的ＴＨＰ－１細胞，免疫印跡分析ＩＬ－］?ｐ??和ｃａｓｐａｓｅ－１活化。［３－ａｃｔｉｎ作為上樣對照。Ｐｒｏ－ｃａｓｐｌ?（ｃａｓｐａｓｅ－１前體），無生物活
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本文編號：2860810