研究背景結(jié)直腸癌(CRC)是全球性三大惡性腫瘤之一,傳統(tǒng)的治療包括手術(shù)、化療、靶向治療和放療等,尚不能有效地控制腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。目前常用的化療藥物和靶向藥物存在毒副作用強、易產(chǎn)生耐藥等尚未解決的難題,故很有必要研發(fā)安全有效抗腫瘤的中藥新藥�！皠�(chuàng)新中藥安留克膠囊(低極性人參皂苷ALK)的研發(fā)”在“十一五”重大新藥創(chuàng)制專項的資助下,完成了候選藥物研究,及新藥臨床前研究的大部分工作,現(xiàn)制備工藝穩(wěn)定,中試產(chǎn)品質(zhì)量可靠,成分含量明確,主含F(xiàn)4、Rh4和R-Rg3等5個低極性人參皂苷單體,急性和長期毒理學(xué)研究均表明其毒性很小,發(fā)明專利被授權(quán)。鑒于低極性人參皂苷ALK抗結(jié)直腸癌的作用尚未明確,本文首次通過動物模型、細胞學(xué)和分子生物學(xué)等多層次系列實驗,擬證實ALK體內(nèi)外抗腸癌的有效性,并以腫瘤微環(huán)境的核心免疫樹突狀細胞(DC)為切入點,研究ALK通過誘導(dǎo)DC分化成熟及功能激活而參與抗腸癌的免疫調(diào)控。為擴大ALK的功能主治提供實驗依據(jù),ALK可望開發(fā)為安全有效抗白血病和結(jié)直腸癌的中藥新藥或輔助藥物。研究方法1..ALK體外抑制腸癌細胞增殖、阻滯周期及誘導(dǎo)的基因表達譜研究用藥中間體ALK干燥粉劑(成品為安留克膠囊)由浙江省中醫(yī)院新藥研發(fā)項目組提供,以人腸癌細胞株HT29、SW480和SW620為靶細胞,經(jīng)不同濃度的ALK(中間體干燥粉劑)處理后,集落生成試驗和MTT比色法檢測ALK抑制腸癌細胞的增殖;流式細胞術(shù)分析ALK阻滯細胞增殖周期。激光共聚焦顯微鏡觀察干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白-1(IFITM1)表達;以及基因芯片分析ALK誘導(dǎo)的基因表達譜。2.ALK在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)抗腸癌的研究采用HT29-GFP細胞制備腸癌荷瘤裸鼠模型,分為模型組、ALK低、中和高劑量(50、100和200mg/kg)治療組及陽性藥物(卡培他濱化療藥、參一膠囊中成藥)對照組。治療7d、14d,小動物活體成像測定各組瘤體的熒光信號值、瘤體積和瘤重,瘤組織病理檢查。實時定量RT-PCR、Western blot和免疫組化等方法,檢測移植瘤組織腫瘤相關(guān)基因及其蛋白的表達水平。3.誘導(dǎo)樹突狀細胞分化成熟及功能激活的研究體外培養(yǎng)小鼠骨髓單個核細胞來源的BMDC,經(jīng)免疫磁珠分離純化并鑒定。流式細胞術(shù)分析ALK促進DC分化成熟的細胞表型;荷瘤裸鼠模型經(jīng)ALK低、中和高劑量治療后,免疫熒光法觀察瘤組織及其周邊成熟DC表面標(biāo)志CD83蛋白的表達。研究結(jié)果1.細胞學(xué)和基因表達譜實驗證實ALK抗腸癌的有效性1.1 集落生成試驗顯示 ALK25、50、75 和 100mg/L 對 HT29、SW480 和 SW620腸癌細胞的抑制率分別為14.47±3.74%～100.00±0%(P分別0.05,0.01),ALK抑制三株細胞的IC50分別為55.86、57.95和63.96mg/L。MTT測定顯示ALK 50、75、100 和 150mg/L 的抑制率分別為 21.45±6.16%～96.42±1.09%(P分別0.05,0.01),ALK抑制三株細胞的IC50分別為88.20、97.32和91.08 mg/L;均提示ALK能夠有效地抑制腸癌細胞增殖,呈劑量依賴性。1.2 ALK 50、75和100 mg/L有效地阻滯HT29、SW480細胞進入增殖周期,停滯于G0/G1期,G0/G1期細胞比例顯著增高(P分別0.05,0.01)。而S期細胞比例則明顯下降(P分別0.05,0.01),增殖指數(shù)也明顯低于對照細胞(P分別0.05,0.01)。表明ALK通過阻滯細胞周期而抑制腸癌細胞增殖,呈劑量依賴性。1.3HT29、SW480腸癌細胞本身表達IFITM1跨膜蛋白,呈綠色熒光強陽性反應(yīng),ALK作用后,綠色熒光強度均明顯減弱;HE染色集落細胞形態(tài)也有變性和退化現(xiàn)象,均表明腸癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制。1.4基因表達譜分析顯示ALK誘導(dǎo)與腫瘤相關(guān)差異表達的基因,通過上調(diào)抑癌基因及DNA損傷修復(fù)基因AKR1B10、p53、CDKN1A、ATF3和PER1等,下調(diào)腫瘤遷移和信號通路相關(guān)ANLN、DKK1和ERCC6L基因,從而抑制腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移。2.ALK在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)抑制腸癌瘤體生長的作用2.1 ALK有效地抑制癌細胞在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)的增殖和生長,低、中和高劑量治療組的瘤重量和體積均明顯低于未治療模型組(P均0.01);而體重均高于卡培他濱化療組和參一膠囊中藥組(P均0.05),提示ALK不但有效地抑制腫瘤生長,而且對提高生活質(zhì)量有一定的優(yōu)勢。2.2 ALK中、高劑量組治療7d,荷瘤裸鼠體內(nèi)瘤體熒光強度明顯低于模型組(P分別0.05,0.01)。治療14d,ALK三個劑量組的瘤體熒光強度均明顯低于模型組(P均0.05,0.01)。病理檢查顯示ALK中、高劑量組的瘤組織有變性和退化,細胞密度明顯下降,均表明其在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)的抗腸癌作用。2.3ALK治療荷瘤裸鼠模型,可通過上調(diào)瘤組織抑癌基因p53、MCC和DCC mRNA及其蛋白的表達;下調(diào)癌基因c-Myc的mRNA及其蛋白的表達,從而發(fā)揮其抗腸癌的作用。3.誘導(dǎo)DC分化成熟及功能激活的作用3.1小鼠骨髓來源的BMDC經(jīng)ALK處理后,DC表面分化標(biāo)志CD83、CD86陽性細胞率顯著增加(P0.05),提示ALK可通過促進小鼠骨髓來源DC的分化成熟,而介導(dǎo)抗腸癌的免疫應(yīng)答。3.2荷瘤裸鼠模型經(jīng)ALK治療后,瘤體外周邊緣紅色熒光陽性反應(yīng)的CD83蛋白表達量顯著增加,提示ALK可通過增加DC在腸癌瘤體周邊的浸潤,而介導(dǎo)抗腸癌的免疫應(yīng)答。結(jié)論1.首次采用體外細胞增殖試驗和基因表達譜分析,證實ALK抗腸癌的有效性,揭示其通過抑制腸癌增殖、阻滯細胞周期,上調(diào)抑癌基因及下調(diào)癌基因而發(fā)揮其抗腸癌的作用。2.ALK在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)也具有抗腸癌的作用,使瘤體積明顯縮小,瘤體熒光信號強度顯著減弱,瘤組織有變性退化,細胞密度明顯下降等現(xiàn)象。同時,通過上調(diào)瘤組織抑癌基因p53、MCC和DCC的mRNA及其蛋白的表達水平,下調(diào)癌基因c-Myc的mRNA及其蛋白的表達水平,從而發(fā)揮其抗腸癌的作用。3.ALK體外能夠有效地誘導(dǎo)小鼠髓系DC的分化成熟,并提高功能活性,在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)可通過增加DC在腸癌瘤體周邊的浸潤,而介導(dǎo)抗腸癌的免疫應(yīng)答,揭示ALK可發(fā)揮多功能及多靶點的抗腸癌作用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

分別為?２０．０８±６．１９％￣?８８．２５±４．１０％?（尸均?＜０．０１?）。??圖３顯示ＡＬＫ２５、５０、７５和１００ｍｇ／Ｌ作用后，對ＳＷ６２０細胞集落生分別為?１４．４７±３．７４％￣９５．７２±５．６２％?（戶分別?＜０．０５，?０．０１?）。??陽性對照藥５－Ｆｕ?ｌｍｇ／Ｌ也顯著地抑制ＨＴ２９、ＳＷ４８０和ＳＷ６２０細胞增集落形成，對集落生成的抑制率達到１００％?（Ｐ＜〇．〇ｌ）。??

ＡＬＫ藥物濃度（ｍｇ／Ｌ）??圖１．集落形成試驗顯示ＡＬＫ抑制ＨＴ２９細胞增殖的作用（＾ｔｓ，ｎ＝５）??＠圖２顯示八１＾２５、５０、７５和１０〇１＾幾作用后，對８評４８０細胞集落生成的??抑制率分別為?２０．０８±６．１９％￣?８８．２５±４．１０％?（尸均?＜０．０１?）。??③

＿??１００??７４．?１??８０?Ｔ?５９：３??教?６０?４２二?３??？?？?３１＇６?■集落數(shù)??２０?－５?８．９??〇?’?款?Ｖ?：ｆ：?￣?〇．〇?０．０?０．０??０?２５?５０?７５?１００?１２５?１５０?５－Ｆｕ??ＡＬＫ藥物濃度（ｍｇ／Ｌ）??ＡＬＫ對ＳＷ４８０細胞集落生成的抑制率??１００??？??〇ｎ?＾＾?１００．?００?１００．?００??９?８８．２５??６〇?＿??１?４０?５７＇５１?＋?抑制率??鍺?２０?＊＾４３＇４３??ｑ?２０＞?０８??２５?５０?７５?１００?１２５?１５０??ＡＬＫ藥物濃度（ｍｇ／Ｌ）??圖２．集落形成試驗顯示ＡＬＫ抑制ＳＷ４８０細胞增殖的作用（ｉ±ｓ，?ｎ＝５）??
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