目的:根據復發(fā)性流產發(fā)展過程,采用基因組學的研究方法,檢測復發(fā)性流產大鼠模型子宮蛻膜中AQP1及AQP2基因表達的情況,探討母胎界面液體轉運的調節(jié)通路,從液體轉運及“腎主水”的角度闡明壽胎丸防治復發(fā)性流產可能的作用機制及物質基礎,為中藥治療復發(fā)性流產提供理論依據。方法:經檢疫1周的健康性成熟且未經交配生育的,60只8周齡、體質量(210.32±10.19)g的SPF級SD雌性大鼠;30只10周齡、體質量(252.83±5.67)g的SPF級SD雄性大鼠。適應性喂養(yǎng)1周后,按雌鼠:雄鼠2:1的比例進行合籠交配,雌性大鼠于次日早晨觀察到其陰道口有陰道栓脫落(即陰道口乳白色固體),且其陰道涂片可見大量精子作為妊娠第1天。將60只孕鼠按照隨機列表法分為6個組,分別為壽胎丸高劑量組、壽胎丸中劑量組,壽胎丸低劑量組、西藥對照組(地屈孕酮)、模型組、正常對照組,每組10只,6組按順序標記為A-F組。妊娠的第1~9天的每日上午,壽胎丸組孕鼠予以壽胎丸中藥藥液灌胃2mL/d,且每組劑量分別為高劑量組(2.0g/Kg)、中劑量組(1.0g/Kg)、低劑量組(0.5g/Kg);地屈孕酮組孕鼠予地屈孕酮水溶液灌胃(3.02mg/Kg),2mL/d;模型組和正常妊娠組孕鼠每日上午予生理鹽水灌胃2ml/d。妊娠的第1~9天的每日下午,正常妊娠組孕鼠予以生理鹽水灌胃2ml/d,其余各組孕鼠均予以羥基脲片水溶液灌胃(450mg/Kg),2ml/d,妊娠的第10天早上A-E組孕鼠予米非司酮片水溶液灌胃(4.0mg/kg),2ml/d。且灌胃期間分別于第1、4、9日測量孕鼠的飲食和飲水量、體質量。所有孕鼠于第11日斷頸處死,開腹分離妊娠子宮,計算各組孕鼠流產率,并分離著床部位的子宮蛻膜組織,用預冷的PBS緩沖液沖洗干凈后,用濾紙吸凈液體,裝于凍存管內,迅速置于液氮灌中保存?zhèn)溆?后凍存在-80℃冰箱中等待檢測,最后用RT-PCR法進行檢測。結果:1.胚胎發(fā)育情況所有孕鼠于第11日(末次給藥24h后)斷頸處死,開腹解剖分離孕鼠妊娠子宮。正常組:可觀察到淡紅色的子宮,胚胎組織大小一致,無竹節(jié)樣改變,且宮腔內無明顯的瘀血及瘀血點,著床點無明顯縮小,胚胎組織均正常未被機化。模型組:可觀察到暗紅色或暗黑色的子宮,胚胎組織大小不一,呈現(xiàn)出竹節(jié)樣的改變,宮腔內可發(fā)現(xiàn)黑色瘀血,或為著床處可見瘀血點,或著床點明顯縮小,或胚胎組織已被機化。地屈孕酮組:可觀察到淡紅色或暗紅色的子宮,胚胎組織大小基本一致,偶為不均一,無竹節(jié)樣改變,宮腔內偶有瘀血點,但著床點無明顯縮小,胚胎組織均正常未被機化。壽胎丸高劑量組、中劑量組、低劑量組:三組孕鼠可觀察到淡紅色或暗紅色的子宮,大部分胚胎組織大小一致,小部分為不均一,無竹節(jié)樣改變,宮腔內偶有瘀血點,但著床點無明顯縮小,胚胎組織均正常未被機化。2.各組孕鼠胚胎流產率的比較與正常妊娠組的孕鼠相比,壽胎丸低劑量組、中劑量組、高劑量組,地屈孕酮組以及模型組的孕鼠的流產率均明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);使用不同藥物進行干預后,與模型組孕鼠進行比較,壽胎丸低劑量組、中劑量組、高劑量組,以及地屈孕酮組孕鼠的流產率均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與地屈孕酮組孕鼠進行比較,壽胎丸高劑量組孕鼠的流產率,無明顯差異(P0.05)。3.各組孕鼠蛻膜組織中AQP1基因表達差異與正常妊娠組對比,模型組P0.01,差異具有顯著統(tǒng)計學意義,提示模型組孕鼠子宮蛻膜組織中AQP1基因表達水平明顯降低;進行藥物干預后,與模型組比較,壽胎丸高劑量組、中劑量組、低劑量組及地屈孕酮組,P值均0.01,差異具有顯著統(tǒng)計學意義,提示藥物干預后的,孕鼠蛻膜組織中AQP1基因表達水平顯著升高;與壽胎丸高劑量組對比,壽胎丸中劑量組、低劑量組P值均0.05,差異有統(tǒng)計學意義,提示高劑量組AQP1基因表達顯著升高;與地屈孕酮組相比,中劑量組P0.05,差異無統(tǒng)計學意義,提示壽胎丸中劑量與地屈孕酮的療效相當。與地屈孕酮組相比,壽胎丸高劑量組P值0.05,差異有統(tǒng)計學意義,提示壽胎丸高劑量組療效優(yōu)于地屈孕酮組。4.各組孕鼠蛻膜組織中AQP2基因表達差異與正常妊娠組比較,模型組P0.01,差異具有顯著統(tǒng)計學意義,提示模型組孕鼠子宮蛻膜組織中AQP2基因表達水平明顯降低;進行藥物干預后,與模型組對比,壽胎丸高劑量組、中劑量組及地屈孕酮組,P值均0.01,差異具有顯著統(tǒng)計學意義,提示藥物干預后的,孕鼠蛻膜組織中AQP2基因表達水平明顯升高;與壽胎丸高劑量組對比,壽胎丸中劑量組、低劑量組、地屈孕酮組P值均0.01,差異有顯著統(tǒng)計學意義,提示高劑量組AQP2基因表達顯著升高;與地屈孕酮組對比,壽胎丸中劑量組P0.05,差異有統(tǒng)計學意義,提示壽胎丸中劑量干預時,比地屈孕酮組療效較差;與地屈孕酮組相比,壽胎丸高劑量組P0.01,差異有顯著統(tǒng)計學意義,提示壽胎丸高劑量組療效優(yōu)于地屈孕酮組。結論:1.壽胎丸能夠促進復發(fā)性流產大鼠模型子宮蛻膜組織的血液循環(huán),防止胚胎著床點的縮小,有利于胚胎的著床發(fā)育,扭轉子宮竹節(jié)樣改變,降低復發(fā)性流產大鼠模型的流產率,保胎療效顯著。2.壽胎丸可能是通過上調復發(fā)性流產大鼠模型子宮蛻膜組織中AQP1、AQP2的基因表達,達到種子安胎的目的。3.復發(fā)性流產大鼠模型子宮蛻膜組織中AQP1、AQP2的基因表達上調水平隨壽胎丸的劑量增大而增大,但壽胎丸的安胎效果與其劑量的關系仍需再進一步研究。
【學位單位】：湖南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

將loading buffer premix和提取的3μL RNA根據5:1的比例進行充分混勻，在140V恒定電壓下進行電泳，當觀察到溴酚藍的前沿處遷移到凝膠總長度的三分之二處時，停止電泳；將凝膠取出并觀察結果。具體如下圖3所示：條帶由下至上依次為5s，18s，28s

胎丸低劑量組 10 39 69 36.11△ ▲屈孕酮組 10 36 74 32.73△ ▲型組 10 53 29 64.63△常組 10 9 98 8.41注：△表示與正常妊娠比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；◆表示屈孕酮組比較，P＞0.05；AQP1、AQP2、及內參actin的擴增曲線及溶解曲線如下圖所示：所有的擴增曲線圖形均為S形，并且上升過程中都趨于穩(wěn)定了平臺期，提示均擴增良好，所得數值均可靠，并能用于實驗分析。以下溶線圖形，全部有單一峰，提示無引物二聚體和非特異性擴增，同時進行擴增獲得單一片段產物，同時特異性良好。

AQP2-1擴增曲線
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本文編號：2857377