目的:根據(jù)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)展過(guò)程,采用基因組學(xué)的研究方法,檢測(cè)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠模型子宮蛻膜中AQP1及AQP2基因表達(dá)的情況,探討母胎界面液體轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)通路,從液體轉(zhuǎn)運(yùn)及“腎主水”的角度闡明壽胎丸防治復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能的作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ),為中藥治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供理論依據(jù)。方法:經(jīng)檢疫1周的健康性成熟且未經(jīng)交配生育的,60只8周齡、體質(zhì)量(210.32±10.19)g的SPF級(jí)SD雌性大鼠;30只10周齡、體質(zhì)量(252.83±5.67)g的SPF級(jí)SD雄性大鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按雌鼠:雄鼠2:1的比例進(jìn)行合籠交配,雌性大鼠于次日早晨觀(guān)察到其陰道口有陰道栓脫落(即陰道口乳白色固體),且其陰道涂片可見(jiàn)大量精子作為妊娠第1天。將60只孕鼠按照隨機(jī)列表法分為6個(gè)組,分別為壽胎丸高劑量組、壽胎丸中劑量組,壽胎丸低劑量組、西藥對(duì)照組(地屈孕酮)、模型組、正常對(duì)照組,每組10只,6組按順序標(biāo)記為A-F組。妊娠的第1~9天的每日上午,壽胎丸組孕鼠予以壽胎丸中藥藥液灌胃2mL/d,且每組劑量分別為高劑量組(2.0g/Kg)、中劑量組(1.0g/Kg)、低劑量組(0.5g/Kg);地屈孕酮組孕鼠予地屈孕酮水溶液灌胃(3.02mg/Kg),2mL/d;模型組和正常妊娠組孕鼠每日上午予生理鹽水灌胃2ml/d。妊娠的第1~9天的每日下午,正常妊娠組孕鼠予以生理鹽水灌胃2ml/d,其余各組孕鼠均予以羥基脲片水溶液灌胃(450mg/Kg),2ml/d,妊娠的第10天早上A-E組孕鼠予米非司酮片水溶液灌胃(4.0mg/kg),2ml/d。且灌胃期間分別于第1、4、9日測(cè)量孕鼠的飲食和飲水量、體質(zhì)量。所有孕鼠于第11日斷頸處死,開(kāi)腹分離妊娠子宮,計(jì)算各組孕鼠流產(chǎn)率,并分離著床部位的子宮蛻膜組織,用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗干凈后,用濾紙吸凈液體,裝于凍存管內(nèi),迅速置于液氮灌中保存?zhèn)溆?后凍存在-80℃冰箱中等待檢測(cè),最后用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:1.胚胎發(fā)育情況所有孕鼠于第11日(末次給藥24h后)斷頸處死,開(kāi)腹解剖分離孕鼠妊娠子宮。正常組:可觀(guān)察到淡紅色的子宮,胚胎組織大小一致,無(wú)竹節(jié)樣改變,且宮腔內(nèi)無(wú)明顯的瘀血及瘀血點(diǎn),著床點(diǎn)無(wú)明顯縮小,胚胎組織均正常未被機(jī)化。模型組:可觀(guān)察到暗紅色或暗黑色的子宮,胚胎組織大小不一,呈現(xiàn)出竹節(jié)樣的改變,宮腔內(nèi)可發(fā)現(xiàn)黑色瘀血,或?yàn)橹蔡幙梢?jiàn)瘀血點(diǎn),或著床點(diǎn)明顯縮小,或胚胎組織已被機(jī)化。地屈孕酮組:可觀(guān)察到淡紅色或暗紅色的子宮,胚胎組織大小基本一致,偶為不均一,無(wú)竹節(jié)樣改變,宮腔內(nèi)偶有瘀血點(diǎn),但著床點(diǎn)無(wú)明顯縮小,胚胎組織均正常未被機(jī)化。壽胎丸高劑量組、中劑量組、低劑量組:三組孕鼠可觀(guān)察到淡紅色或暗紅色的子宮,大部分胚胎組織大小一致,小部分為不均一,無(wú)竹節(jié)樣改變,宮腔內(nèi)偶有瘀血點(diǎn),但著床點(diǎn)無(wú)明顯縮小,胚胎組織均正常未被機(jī)化。2.各組孕鼠胚胎流產(chǎn)率的比較與正常妊娠組的孕鼠相比,壽胎丸低劑量組、中劑量組、高劑量組,地屈孕酮組以及模型組的孕鼠的流產(chǎn)率均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);使用不同藥物進(jìn)行干預(yù)后,與模型組孕鼠進(jìn)行比較,壽胎丸低劑量組、中劑量組、高劑量組,以及地屈孕酮組孕鼠的流產(chǎn)率均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與地屈孕酮組孕鼠進(jìn)行比較,壽胎丸高劑量組孕鼠的流產(chǎn)率,無(wú)明顯差異(P0.05)。3.各組孕鼠蛻膜組織中AQP1基因表達(dá)差異與正常妊娠組對(duì)比,模型組P0.01,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示模型組孕鼠子宮蛻膜組織中AQP1基因表達(dá)水平明顯降低;進(jìn)行藥物干預(yù)后,與模型組比較,壽胎丸高劑量組、中劑量組、低劑量組及地屈孕酮組,P值均0.01,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示藥物干預(yù)后的,孕鼠蛻膜組織中AQP1基因表達(dá)水平顯著升高;與壽胎丸高劑量組對(duì)比,壽胎丸中劑量組、低劑量組P值均0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示高劑量組AQP1基因表達(dá)顯著升高;與地屈孕酮組相比,中劑量組P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示壽胎丸中劑量與地屈孕酮的療效相當(dāng)。與地屈孕酮組相比,壽胎丸高劑量組P值0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示壽胎丸高劑量組療效優(yōu)于地屈孕酮組。4.各組孕鼠蛻膜組織中AQP2基因表達(dá)差異與正常妊娠組比較,模型組P0.01,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示模型組孕鼠子宮蛻膜組織中AQP2基因表達(dá)水平明顯降低;進(jìn)行藥物干預(yù)后,與模型組對(duì)比,壽胎丸高劑量組、中劑量組及地屈孕酮組,P值均0.01,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示藥物干預(yù)后的,孕鼠蛻膜組織中AQP2基因表達(dá)水平明顯升高;與壽胎丸高劑量組對(duì)比,壽胎丸中劑量組、低劑量組、地屈孕酮組P值均0.01,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示高劑量組AQP2基因表達(dá)顯著升高;與地屈孕酮組對(duì)比,壽胎丸中劑量組P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示壽胎丸中劑量干預(yù)時(shí),比地屈孕酮組療效較差;與地屈孕酮組相比,壽胎丸高劑量組P0.01,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示壽胎丸高劑量組療效優(yōu)于地屈孕酮組。結(jié)論:1.壽胎丸能夠促進(jìn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠模型子宮蛻膜組織的血液循環(huán),防止胚胎著床點(diǎn)的縮小,有利于胚胎的著床發(fā)育,扭轉(zhuǎn)子宮竹節(jié)樣改變,降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠模型的流產(chǎn)率,保胎療效顯著。2.壽胎丸可能是通過(guò)上調(diào)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠模型子宮蛻膜組織中AQP1、AQP2的基因表達(dá),達(dá)到種子安胎的目的。3.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠模型子宮蛻膜組織中AQP1、AQP2的基因表達(dá)上調(diào)水平隨壽胎丸的劑量增大而增大,但壽胎丸的安胎效果與其劑量的關(guān)系仍需再進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

將loading buffer premix和提取的3μL RNA根據(jù)5:1的比例進(jìn)行充分混勻，在140V恒定電壓下進(jìn)行電泳，當(dāng)觀(guān)察到溴酚藍(lán)的前沿處遷移到凝膠總長(zhǎng)度的三分之二處時(shí)，停止電泳；將凝膠取出并觀(guān)察結(jié)果。具體如下圖3所示：條帶由下至上依次為5s，18s，28s

胎丸低劑量組 10 39 69 36.11△ ▲屈孕酮組 10 36 74 32.73△ ▲型組 10 53 29 64.63△常組 10 9 98 8.41注：△表示與正常妊娠比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；◆表示屈孕酮組比較，P＞0.05；AQP1、AQP2、及內(nèi)參actin的擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)如下圖所示：所有的擴(kuò)增曲線(xiàn)圖形均為S形，并且上升過(guò)程中都趨于穩(wěn)定了平臺(tái)期，提示均擴(kuò)增良好，所得數(shù)值均可靠，并能用于實(shí)驗(yàn)分析。以下溶線(xiàn)圖形，全部有單一峰，提示無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增獲得單一片段產(chǎn)物，同時(shí)特異性良好。

AQP2-1擴(kuò)增曲線(xiàn)
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本文編號(hào)：2857377