背景:膠質(zhì)瘤(glioma)是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見、最具侵襲性的腫瘤,同時(shí)具有惡性程度高、預(yù)后差、發(fā)病率和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是一種用于治療惡性膠質(zhì)瘤的一線化療藥物。然而,很多膠質(zhì)瘤患者對替莫唑胺具有耐藥性。因此,我們迫切地需要更有效的治療方案。蟲草素(cordycepin,COR)是一種具有抗腫瘤作用的天然化學(xué)物質(zhì),但其詳細(xì)作用機(jī)制仍有待研究。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)能夠修復(fù)受損的DNA,并且有助于膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的耐藥性的產(chǎn)生。Wnt/β-catenin信號通路能夠調(diào)控MGMT基因的表達(dá),蟲草素能夠調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。然而,蟲草素能否通過下調(diào)β-catenin通路來抑制MGMT表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的化療敏感性,目前國內(nèi)外尚無此方面研究。目的:本研究的目的是用膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及移植瘤鼠模型來研究β-catenin在蟲草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGMT抑制及減少替莫唑胺耐藥中的作用,并探討其分子機(jī)制。方法：在本研究中,通過MTT法檢測藥物對細(xì)胞存活率的影響,通過細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察蟲草素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響,通過流式細(xì)胞學(xué)檢測方法研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡方式及細(xì)胞周期的變化,通過DCFH-DA探針檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成水平的變化,通過DTNB-GSSG檢測法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的變化,通過實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT m RNA表達(dá)水平的變化,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法來研究MGMT和β-catenin在蟲草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡及減少替莫唑胺耐藥中的作用,通過免疫蛋白印跡法(western blotting)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞及膠質(zhì)瘤移植瘤組織中相關(guān)蛋白分子的表達(dá)水平變化,通過免疫組織化學(xué)染色法觀察膠質(zhì)瘤移植瘤組織中相關(guān)蛋白分子的表達(dá)水平的變化。通過建立大鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型和裸鼠皮下移植瘤模型來驗(yàn)證蟲草素在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的作用。結(jié)果:1、MTT法檢測結(jié)果表明蟲草素能夠降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率,對正常細(xì)胞存活率影響較小。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蟲草素能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果表明蟲草素能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。免疫蛋白印跡結(jié)果表明在蟲草素的作用下,膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bcl-2和Cyclin B1蛋白表達(dá)減少。同時(shí),Bax,cleaved PARP-1和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加。2、蟲草素能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT基因的表達(dá)。同時(shí),聯(lián)合應(yīng)用蟲草素和替莫唑胺在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中具有協(xié)同作用。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)MGMT能夠逆轉(zhuǎn)蟲草素和替莫唑胺的協(xié)同作用。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中基因沉默β-catenin能夠抑制MGMT m RNA和蛋白的表達(dá),并且增強(qiáng)替莫唑胺的化療敏感性。3、在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,蟲草素能夠抑制p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表達(dá)。GSK-3β抑制劑(CHIR-99021)或過表達(dá)β-catenin能夠逆轉(zhuǎn)蟲草素在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中抑制MGMT表達(dá),降低細(xì)胞存活率,誘導(dǎo)凋亡以及減少替莫唑胺耐藥的作用。4、DCFH-DA探針檢測結(jié)果表明蟲草素能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS過度產(chǎn)生,DTNB-GSSG檢測法的結(jié)果表明蟲草素能夠使膠質(zhì)瘤細(xì)胞GSH的生成減少。GSK-3β抑制劑(CHIR-99021)預(yù)處理后,蟲草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS過度產(chǎn)生的效果受到抑制,同時(shí)蟲草素抑制GSH產(chǎn)生的效果得到逆轉(zhuǎn)。抗氧化劑(NAC)能夠逆轉(zhuǎn)蟲草素誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS過度產(chǎn)生,生存率下降,細(xì)胞凋亡,MGMT,p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)減少,減少替莫唑胺耐藥的作用。5、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,蟲草素能夠抑制腫瘤生長,降低MGMT,p-GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)。相比于單獨(dú)用藥,聯(lián)合應(yīng)用蟲草素和替莫唑胺能夠明顯延長荷瘤大鼠的中位生存期。結(jié)論:1、蟲草素在體內(nèi)和體外中均可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力,增強(qiáng)替莫唑胺的化療敏感性。2、蟲草素通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT的表達(dá),從而增強(qiáng)替莫唑胺的化療敏感性。3、蟲草素可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生β-catenin依賴的MGMT抑制,從而增強(qiáng)替莫唑胺的化療敏感性。4、蟲草素通過線粒體中ROS的過度產(chǎn)生導(dǎo)致β-catenin依賴的MGMT抑制,從而增強(qiáng)替莫唑胺的化療敏感性。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
前言
中文摘要
Abstract
英文縮寫詞
第1章 緒論
第2章 文獻(xiàn)綜述
    2.1 膠質(zhì)瘤
        2.1.1 膠質(zhì)瘤簡介
        2.1.2 膠質(zhì)瘤的臨床特點(diǎn)
        2.1.3 膠質(zhì)瘤的分級和分子分型
        2.1.4 膠質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀
    2.2 替莫唑胺和MGMT
        2.2.1 替莫唑胺簡介
        2.2.2 替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤的機(jī)制
        2.2.3 替莫唑胺耐藥與MGMT
    2.3 Wnt/β-catenin信號通路
        2.3.1 Wnt/β-catenin信號通路概述
        2.3.2 Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤
    2.4 ROS
    2.5 蟲草素
        2.5.1 蟲草素概述
        2.5.2 蟲草素在腫瘤治療中的應(yīng)用
第3章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)器材與試劑
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)器材
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
    3.3 大鼠及裸鼠飼養(yǎng)
    3.4 實(shí)驗(yàn)試劑配制及儲存
    3.5 實(shí)驗(yàn)技術(shù)
        3.5.1 MTT法檢測腫瘤細(xì)胞存活率
        3.5.2 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力
        3.5.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡水平
        3.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期
        3.5.5 細(xì)胞內(nèi)ROS的測定
        3.5.6 DTNB-GSSG法檢測細(xì)胞中GSH水平
        3.5.7 實(shí)時(shí)定量PCR
        3.5.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.5.9 Western blot法檢測細(xì)胞及組織內(nèi)相關(guān)蛋白變化
        3.5.10 免疫組織化學(xué)染色法檢測組織中相關(guān)蛋白水平
        3.5.11 大鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下移植瘤模型實(shí)驗(yàn)
    3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 蟲草素抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力
        4.1.1 蟲草素以時(shí)間和濃度依賴的方式抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力
        4.1.2 蟲草素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖
    4.2 蟲草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和G2-M期周期阻滯
        4.2.1 蟲草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡
        4.2.2 蟲草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G2-M期周期阻滯
    4.3 蟲草素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT表達(dá)并增強(qiáng)TMZ的化療敏感性
        4.3.1 蟲草素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT表達(dá)
        4.3.2 蟲草素增強(qiáng)TMZ在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的化療敏感性
    4.4 MGMT在蟲草素減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ耐藥中發(fā)揮重要作用
    4.5 基因沉默β-catenin能夠抑制MGMT表達(dá)并增強(qiáng)TMZ的化療敏感性
    4.6 β-catenin在蟲草素誘導(dǎo)的MGMT抑制及減少TMZ耐藥中發(fā)揮重要作用
        4.6.1 蟲草素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路
        4.6.2 CHIR-99021 逆轉(zhuǎn)蟲草素誘導(dǎo)的MGMT抑制和減少TMZ耐藥
        4.6.3 過表達(dá)β-catenin逆轉(zhuǎn)蟲草素誘導(dǎo)的MGMT抑制和減少TMZ耐藥
    4.7 β-catenin在蟲草素誘導(dǎo)ROS過度產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用
    4.8 ROS在蟲草素誘導(dǎo)的β-catenin抑制、MGMT抑制及減少TMZ耐藥中發(fā)揮重要作用
    4.9 蟲草素抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長并與TMZ具有協(xié)同作用
        4.9.1 蟲草素抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長
        4.9.2 在體內(nèi)蟲草素和TMZ聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗膠質(zhì)瘤作用
第5章 討論
第6章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果
致謝

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本文編號：2857074