目的觀察陽和湯含藥血清對硝普鈉誘導的凋亡模型中軟骨細胞促凋亡因子Bax、Caspase-9、Caspase-3和抗凋亡因子Bc1-2表達量的影響,探討陽和湯含藥血清對軟骨細胞凋亡的影響。方法1.健康2月齡SPF級SD大鼠40只,雌雄不限,按“動物和人體表面積折算的等效劑量比率表”計算出大鼠每日用藥劑量,予以陽和湯灌胃,一天2次(早晚各一次),連續(xù)7天,最后1天連續(xù)2次灌胃,中間間隔2h后,予以10%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血,低溫高速離心后制備含藥血清。2.采用機械-酶消法消化4周齡SPF級SD大鼠膝關節(jié)和股骨頭軟骨組織并分離出軟骨細胞,建立體外培養(yǎng)體系并用甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原酶鑒定。在倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細胞生長狀況。3.用1mMSNP誘導第2代軟骨細胞制作退變軟骨細胞模型,在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化進行鑒定。4.MTT法檢測陽和湯含藥血清對抑制退變軟骨細胞凋亡的最佳干預時間和干預濃度;流式細胞術檢測細胞凋亡率;Q-PCR法檢測Bax、Bc1-2、Caspase-9、Caspase-3基因表達情況;Western Blot法檢測Bax、Bc1-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達情況。結果1.第2代軟骨細胞形態(tài)大小一致、胞漿豐富、胞核清晰、生長狀態(tài)良好;經(jīng)甲苯胺藍染色后,細胞核被染成深藍色,細胞間質及胞漿均被染成淡藍色。經(jīng)Ⅱ型膠原染色后,陽性對照組胞漿區(qū)為棕黃色。采用1mMSNP誘導后的軟骨細胞,形態(tài)大小不規(guī)則、核變大、胞膜胞漿不清晰、部分細胞懸浮于培養(yǎng)基中。2.MTT結果表明,陽和湯含藥血清抑制退變軟骨細胞凋亡的最佳干預濃度和干預時間分別為10%含藥血清和48h。流式細胞術分析表明,陽和湯含藥血清組能顯著降低退變軟骨細胞的凋亡率。Q-PCR和Westem-Blot法檢測結果顯示陽和湯含藥血清組能顯著降低促凋亡因子Bax、Caspase-9、Caspase-3基因和蛋白的表達量,提高抗凋亡因子Bc1-2基因和蛋白的表達量。結論陽和湯含藥血清能通過降低經(jīng)SNP誘導凋亡模型軟骨細胞中促凋亡因子Bax及Caspase-9、Caspase-3表達,上調抗凋亡因子Bc1-2表達,有效調節(jié)線粒體凋亡通路,從而有效抑制軟骨細胞凋亡,減少軟骨基質降解,有利于修復軟骨,為陽和湯預防和延緩OA病情提供理論依據(jù)。
【學位單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

鏡下觀察細胞外觀形態(tài)近似圓形或卵圓形，形態(tài)大小基本一致，且遮光性強為原代??軟骨細胞；接種培養(yǎng)４８ｈ后大多數(shù)軟骨細胞開始貼壁生長，分裂增殖速度加快，形似扁??平狀，胞漿豐富，胞核清晰，具有〗－２個核仁（圖１－Ａ）；培養(yǎng)４ｄ后，軟骨細胞出現(xiàn)成簇生??長現(xiàn)象，形似圓形或橢圓形，且細胞以聚集重疊生長的方式沿瓶壁擴散（圖１－Ｂ）；?８ｄ后細??胞分布均勻，鋪滿瓶底約９０％，邊界清晰，形態(tài)結構一致，呈明顯的鋪路石狀（圖１－Ｃ）；??本實驗使用第２代軟骨細胞因其生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)結構一致，胞漿胞膜清晰，增??殖速度較快（圖１－Ｄ）。??■Ｈ??■■??Ｃ?Ｄ??圖１軟骨細胞形態(tài)學特征（１００Ｘ）??３．?２軟骨細胞的鑒定結果??３．２．?１甲苯胺藍染色??如圖２可見，經(jīng)甲苯胺藍染色法染色后，光鏡下顯示，正常軟骨細胞的細胞核被染??１６??

圖２甲苯胺藍染色（１００Ｘ）??３．２．２?ＩＩ型膠原染色??如圖３所示，經(jīng)ＩＩ型膠原染色后，陰性對照組胞漿區(qū)顏色透明，實驗組胞漿區(qū)為棕??

３．?４含藥血清抑制退變軟骨細胞凋亡的最佳干預時間與干預濃度??用ＭＴＴ法檢測含藥血清在不同濃度（５％、１０％、１５％、２０％）及不同時間（２４ｈ、??４８ｈ和７２ｈ）對退變軟骨細胞凋亡的影響。如表１、圖５－１所示，模型組和各濃度含藥血??清組ＯＤ值均顯著低于空白組，差異具有統(tǒng)計意義（Ｐ＜０．０１）。各濃度含藥血清組ＯＤ??值顯著高于模型組ＯＤ值（Ｐ＜０．０１），顯著低于空白組（Ｐ＜０．０１）。各實驗組間比較顯示，??在干預２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后，１０％含藥血清組均顯著高于５％、１５％、２０％含藥血清組，差??異具有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜０．０１）。以上數(shù)據(jù)表明，陽和湯含藥血清抑制退變軟骨細胞凋亡??的最佳干預濃度為１０％。如表１、圖５－２所示，從最佳干預濃度上觀察不同干預時間結??果顯示，４８ｈ組ＯＤ值顯著高于２４ｈ組和７２ｈ組，差異具有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜０．０１）。以??上實驗結果表明，陽和湯含藥血清抑制退變軟骨細胞凋亡的最佳干預時間和干預濃度分??別為４８?ｈ和１０％含藥血清。??１８??
【參考文獻】

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本文編號：2857226