目的觀察陽和湯含藥血清對硝普鈉誘導(dǎo)的凋亡模型中軟骨細(xì)胞促凋亡因子Bax、Caspase-9、Caspase-3和抗凋亡因子Bc1-2表達(dá)量的影響,探討陽和湯含藥血清對軟骨細(xì)胞凋亡的影響。方法1.健康2月齡SPF級SD大鼠40只,雌雄不限,按“動物和人體表面積折算的等效劑量比率表”計算出大鼠每日用藥劑量,予以陽和湯灌胃,一天2次(早晚各一次),連續(xù)7天,最后1天連續(xù)2次灌胃,中間間隔2h后,予以10%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血,低溫高速離心后制備含藥血清。2.采用機(jī)械-酶消法消化4周齡SPF級SD大鼠膝關(guān)節(jié)和股骨頭軟骨組織并分離出軟骨細(xì)胞,建立體外培養(yǎng)體系并用甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原酶鑒定。在倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長狀況。3.用1mMSNP誘導(dǎo)第2代軟骨細(xì)胞制作退變軟骨細(xì)胞模型,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行鑒定。4.MTT法檢測陽和湯含藥血清對抑制退變軟骨細(xì)胞凋亡的最佳干預(yù)時間和干預(yù)濃度;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;Q-PCR法檢測Bax、Bc1-2、Caspase-9、Caspase-3基因表達(dá)情況;Western Blot法檢測Bax、Bc1-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.第2代軟骨細(xì)胞形態(tài)大小一致、胞漿豐富、胞核清晰、生長狀態(tài)良好;經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后,細(xì)胞核被染成深藍(lán)色,細(xì)胞間質(zhì)及胞漿均被染成淡藍(lán)色。經(jīng)Ⅱ型膠原染色后,陽性對照組胞漿區(qū)為棕黃色。采用1mMSNP誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞,形態(tài)大小不規(guī)則、核變大、胞膜胞漿不清晰、部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。2.MTT結(jié)果表明,陽和湯含藥血清抑制退變軟骨細(xì)胞凋亡的最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時間分別為10%含藥血清和48h。流式細(xì)胞術(shù)分析表明,陽和湯含藥血清組能顯著降低退變軟骨細(xì)胞的凋亡率。Q-PCR和Westem-Blot法檢測結(jié)果顯示陽和湯含藥血清組能顯著降低促凋亡因子Bax、Caspase-9、Caspase-3基因和蛋白的表達(dá)量,提高抗凋亡因子Bc1-2基因和蛋白的表達(dá)量。結(jié)論陽和湯含藥血清能通過降低經(jīng)SNP誘導(dǎo)凋亡模型軟骨細(xì)胞中促凋亡因子Bax及Caspase-9、Caspase-3表達(dá),上調(diào)抗凋亡因子Bc1-2表達(dá),有效調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路,從而有效抑制軟骨細(xì)胞凋亡,減少軟骨基質(zhì)降解,有利于修復(fù)軟骨,為陽和湯預(yù)防和延緩OA病情提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

鏡下觀察細(xì)胞外觀形態(tài)近似圓形或卵圓形，形態(tài)大小基本一致，且遮光性強(qiáng)為原代??軟骨細(xì)胞；接種培養(yǎng)４８ｈ后大多數(shù)軟骨細(xì)胞開始貼壁生長，分裂增殖速度加快，形似扁??平狀，胞漿豐富，胞核清晰，具有〗－２個核仁（圖１－Ａ）；培養(yǎng)４ｄ后，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)成簇生??長現(xiàn)象，形似圓形或橢圓形，且細(xì)胞以聚集重疊生長的方式沿瓶壁擴(kuò)散（圖１－Ｂ）；?８ｄ后細(xì)??胞分布均勻，鋪滿瓶底約９０％，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，呈明顯的鋪路石狀（圖１－Ｃ）；??本實驗使用第２代軟骨細(xì)胞因其生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，胞漿胞膜清晰，增??殖速度較快（圖１－Ｄ）。??■Ｈ??■■??Ｃ?Ｄ??圖１軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（１００Ｘ）??３．?２軟骨細(xì)胞的鑒定結(jié)果??３．２．?１甲苯胺藍(lán)染色??如圖２可見，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色法染色后，光鏡下顯示，正常軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核被染??１６??

圖２甲苯胺藍(lán)染色（１００Ｘ）??３．２．２?ＩＩ型膠原染色??如圖３所示，經(jīng)ＩＩ型膠原染色后，陰性對照組胞漿區(qū)顏色透明，實驗組胞漿區(qū)為棕??

３．?４含藥血清抑制退變軟骨細(xì)胞凋亡的最佳干預(yù)時間與干預(yù)濃度??用ＭＴＴ法檢測含藥血清在不同濃度（５％、１０％、１５％、２０％）及不同時間（２４ｈ、??４８ｈ和７２ｈ）對退變軟骨細(xì)胞凋亡的影響。如表１、圖５－１所示，模型組和各濃度含藥血??清組ＯＤ值均顯著低于空白組，差異具有統(tǒng)計意義（Ｐ＜０．０１）。各濃度含藥血清組ＯＤ??值顯著高于模型組ＯＤ值（Ｐ＜０．０１），顯著低于空白組（Ｐ＜０．０１）。各實驗組間比較顯示，??在干預(yù)２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后，１０％含藥血清組均顯著高于５％、１５％、２０％含藥血清組，差??異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）。以上數(shù)據(jù)表明，陽和湯含藥血清抑制退變軟骨細(xì)胞凋亡??的最佳干預(yù)濃度為１０％。如表１、圖５－２所示，從最佳干預(yù)濃度上觀察不同干預(yù)時間結(jié)??果顯示，４８ｈ組ＯＤ值顯著高于２４ｈ組和７２ｈ組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）。以??上實驗結(jié)果表明，陽和湯含藥血清抑制退變軟骨細(xì)胞凋亡的最佳干預(yù)時間和干預(yù)濃度分??別為４８?ｈ和１０％含藥血清。??１８??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2857226