目的:硫磺熏蒸養(yǎng)護(hù)方法作為一種防霉、防腐和防蟲蛀的加工儲藏的方法既有優(yōu)點(diǎn)又有缺點(diǎn),本課題自制硫磺熏蒸土茯苓藥材并提取分離純化得到硫磺熏蒸土茯苓粗多糖和非硫磺熏蒸土茯苓粗多糖,對兩者的理化性質(zhì)的改變進(jìn)行一系列考察比較,重點(diǎn)揭示了硫磺熏蒸是否對免疫細(xì)胞造成毒性和降低土茯苓多糖免疫調(diào)節(jié)方面的藥效,并探討其作用機(jī)制,填補(bǔ)了硫磺熏蒸關(guān)于免疫方面的研究空白,為取消或規(guī)范化硫熏方法提供了科學(xué)扎實(shí)的依據(jù)和參考。方法:1.制備經(jīng)硫磺熏蒸的土茯苓藥材,經(jīng)過熱水回流提取、乙醇醇沉和Sevage試劑除蛋白質(zhì)等方法分離純化得到硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖和非硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖。2.從外觀上,在超純水、無水乙醇、甲醇、乙醚、丙酮和三氯乙酸溶劑中的溶解性,粗多糖提取率,苯酚-硫酸法測定總糖含量,元素組成分析和紅外光譜等理化性質(zhì)對硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖和非硫磺熏蒸的土茯苓粗多糖進(jìn)行比較分析。3.通過MTT法檢測硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖對巨噬細(xì)胞毒性的影響。4.通過ELISA試劑盒測定巨噬細(xì)胞上清培養(yǎng)液中分泌的TNF-α和IL-6的含量;通過RT-PCR法測定巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá),考察硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞免疫相關(guān)因子的影響。5.通過CFSE增殖實(shí)驗(yàn)檢測硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖對原代提取的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。6.通過流式細(xì)胞儀檢測硫熏和非硫熏土茯苓粗多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群表型比例的影響。7.通過Hoechst33258對巨噬細(xì)胞細(xì)胞核進(jìn)行染色、流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期和線粒體膜電位的改變,考察硫熏后的土茯苓粗多糖是否促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡。8.RT-PCR法檢測巨噬細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax和Caspase-8的mRNA表達(dá)量,Western Blot法檢測MAPKS信號通路和Bax和Caspase-8的蛋白表達(dá)量,考察并探討硫熏土茯苓粗多糖抑制免疫細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡和降低土茯苓多糖免疫調(diào)節(jié)方面藥效可能的作用機(jī)制。結(jié)果:1.土茯苓藥材經(jīng)過"水提-醇沉-除蛋白-冷凍干燥"等步驟后,得到硫磺熏蒸土茯苓粗多糖干燥樣品(SSGRP)20.85 g,提取率為4.17%,非硫磺熏蒸土茯苓粗多糖干燥樣品(NSGRP)6.35 g,提取率為1.27%。2.經(jīng)過硫磺熏蒸后,土茯苓藥材顏色由比較暗黃變成可明顯看出色澤變白,證明通過硫磺熏蒸確實(shí)能起到藥材漂白的作用。兩種粗多糖樣品在不同溶劑中的溶解性各有差異。3.根據(jù)苯酚-硫酸法,土茯苓粗多糖樣品SSGRP和NSGRP的紫外光譜掃描均在490nm處附近測得有最大吸收峰,故采用490nm作為最大吸收波長。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算測得SSGRP和NSGRP中總糖含量分別為46.43%和42.18%,硫熏后土茯苓粗多糖含量檢測值增加4.25%。4.經(jīng)過硫磺熏蒸后,SSGRP中硫元素的含量比NSGRP高出2倍多,碳?xì)湓鼗疽恢?表明了硫磺熏蒸確實(shí)會造成二氧化硫的殘留,與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。5.紅外光譜分析中,SSGRP與NSGRP在整體峰數(shù)、峰形、峰位上相似,但在3400-2900 cm-1之間,兩者吸收峰強(qiáng)度有差異,推測多糖類結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變。在波長1700-1300 cm-1之間,SSGRP峰形尖銳,且在約1652.7 cm-1處有明顯左移現(xiàn)象。而在波長1160-900 cm-1之間,SSGRP吸收峰強(qiáng)度都較NSGRP弱,且峰形較尖銳,故推測經(jīng)硫熏后硫氧雙鍵結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變。6.MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,SSGRP能明顯降低巨噬細(xì)胞的存活率并呈濃度依賴性,在1000-8000 μg/mL濃度范圍內(nèi)細(xì)胞存活率從93.18 ± 1.67%下降至60.95 土1.77%,而NSGRP對巨噬細(xì)胞的增殖無明顯影響,表明硫磺熏蒸使本來無毒性的土茯苓粗多糖增加了一定的細(xì)胞毒性,細(xì)胞增殖抑制作用明顯。7.ELISA實(shí)驗(yàn)中,非硫熏的土茯苓粗多糖能增加巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的作用,具有免疫調(diào)節(jié)的功效,但經(jīng)過硫磺熏蒸后,SSGRP組雖然仍可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6因子,但分泌量明顯比NSGRP組減少,具有顯著地統(tǒng)計學(xué)意義,這說明了硫磺熏蒸會降低土茯苓粗多糖應(yīng)有的免疫調(diào)節(jié)方面的藥效。RT-PCR實(shí)驗(yàn)中TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)與相應(yīng)的細(xì)胞因子分泌結(jié)果相一致,表明硫磺熏蒸降低土茯苓粗多糖免疫調(diào)節(jié)方面的藥效可能是通過減少細(xì)胞因子相應(yīng)的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。8.CFSE增殖實(shí)驗(yàn)說明土茯苓粗多糖本來具有促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的功能,多數(shù)淋巴細(xì)胞已增殖到第六代,而經(jīng)過硫磺熏蒸后,粗多糖的增殖作用有所減弱,多使細(xì)胞停留在第五代如空白對照組,SSGRP抑制淋巴細(xì)胞的增殖有可能降低土茯苓粗多糖免疫調(diào)節(jié)的藥效。而淋巴細(xì)胞亞群表型的檢測中,SSGRP和NSGRP在濃度500-2000μg/mL的范圍內(nèi),并沒有影響小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群表型的比例,說明土茯苓粗多糖SSGRP和NSGRP對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響有可能與T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量上的比例無關(guān)。9.Hoechst33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)說明隨著硫熏SSGRP濃度的增加,細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染的亮藍(lán)色熒光增多,存在明顯的量效關(guān)系,表明SSGRP確實(shí)誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的凋亡。10.Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明隨著SSGRP藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡率從空白對照組的15.7%上升至30.6%,細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)SSGRP處理組GO/G1期和G2/M期細(xì)胞比例的減少及S期細(xì)胞比例的增多說明硫磺熏蒸使巨噬細(xì)胞的周期停留在S期,發(fā)生S期阻滯,使其不能順利進(jìn)行DNA的復(fù)制,影響細(xì)胞進(jìn)入下一次的分裂,從而截斷細(xì)胞的分化再生,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。SSGRP還能使巨噬細(xì)胞的線粒體膜電位下降。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明土茯苓粗多糖本來沒有促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡的作用,而經(jīng)過硫磺熏蒸后的土茯苓粗多糖卻增加了巨噬細(xì)胞的凋亡率,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,說明其對巨噬細(xì)胞的增殖抑制作用是通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。11.熒光定量PCR和Western Blot法考察硫磺熏蒸促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明土茯苓粗多糖NSGRP的凋亡相關(guān)基因Bax和Caspase-8并未被激活,但是經(jīng)過硫磺熏蒸處理后,SSGRP通過增加促凋亡蛋白Bax的基因和蛋白表達(dá)量,從而啟動并激活凋亡酶Caspase-8的基因和蛋白表達(dá),引起產(chǎn)生一系列的Caspase級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡。12.非硫熏的土茯苓粗多糖NSGRP能上調(diào)巨噬細(xì)胞的MAPK信號通路中磷酸化ERK和JNK蛋白的表達(dá),而經(jīng)過硫磺熏蒸后,蛋白的相對表達(dá)量均降低,說明SSGRP明顯抑制了 P-ERK和P-JNK蛋白表達(dá)量的升高,對MAPK通路有抑制作用。結(jié)論:本課題的研究結(jié)果表明,硫磺熏蒸改變了土茯苓粗多糖的多種理化性質(zhì),并造成了二氧化硫的殘留增多,抑制了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和小鼠脾臟淋巴細(xì)胞兩種免疫細(xì)胞的增殖和促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡,使得本來無毒性的土茯苓多糖產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性,影響免疫系統(tǒng)的功能,另外還降低了土茯苓粗多糖原有免疫調(diào)節(jié)方面的藥效,并探討了硫磺熏蒸對土茯苓多糖造成影響的作用機(jī)制與促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-8基因和蛋白表達(dá)量增加和抑制MAPK信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。為取消或規(guī)范化硫磺熏蒸這種藥材養(yǎng)護(hù)方法提供了科學(xué)扎實(shí)的依據(jù)和參考。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

苓的研究進(jìn)展??．１?土茯苓的概況??苳是百合科植物光葉菝葜（Ｓ’ｆｆｌｉＪａｘｇｉａｂｒａ?）的干燥根蓮，為多年生??緣狀的灌木，生于海拔較低的灌木叢或山坡、河谷林邊的半陰地，多于夏、秋??，入藥部分僅采取其干燥后的根莖，除去須根、泥沙，洗凈后干燥入藥，或??切成薄片，曬干入藥。土茯苓主要分布于我國廣東、廣西、湖南、湖北、四??、陜西、甘肅、安徽、浙江、江西、福建和臺灣等地［１］。??苓出自《滇南本草》，并入《本草拾遺》草禹余糧，而其名字始見于《本草??文中記載：“土茯苳，有赤白二種，入藥用白者良�！逼湫云�，氣微，味微甘??。歸肝胃脾經(jīng)，具有涼血解毒、和中除濕及通利關(guān)節(jié)等藥效�！毒V目》載此藥??胃，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)。治拘攣骨痛，惡瘡癰腫，解汞粉、銀朱毒”。??上用于治療梅毒及汞中毒所致的筋骨疼痛，肢體痙攣；濕熱淋濁，帶下，癰??，疥癬等疾病，是一味常用的中藥材［Ｍ］。同時，土茯苓可當(dāng)作藥食同源的一??常被人們作為煲湯健脾除濕和制作龜苓膏的原料食材。??

爆??圖２－１?土茯苓原藥材和粗多糖樣品圖片??如圖２－１－Ａ，左側(cè)未經(jīng)硫磺熏蒸的土茯苓藥材顏色較暗黃，右側(cè)為經(jīng)過硫磺熏蒸??后的土茯苓藥材，可明顯看出色澤變白。圖２－１－Ｂ為提取干燥后對應(yīng)的非硫磺熏蒸土??茯苓粗多糖粉末（ＮＳＧＲＰ）和硫磺熏蒸土茯苓粗多糖粉末（ＳＳＧＲＰ）。分別稱�。保�?ｔｎｇ??樣品溶于ｌｍｌ試劑，檢測兩種粗多糖樣品在不同溶劑中溶解性的差異，如表２－３所??示，經(jīng)過硫磺熏蒸后的土茯苓粗多糖樣品易溶于水和三氯乙酸，呈淡乳白色，不溶于??乙醇、甲醇、乙醚和丙酮等有機(jī)溶劑中。而沒有經(jīng)過硫磺熏蒸的粗多糖樣品在水、乙??１３??

?２．?４．?２．?２粗多糖最大吸收波長的確定??如圖２－２所示，土茯苓粗多糖樣品ＳＳＧＲＰ和ＮＳＧＲＰ的紫外光譜掃描均在４９０?ｎｍ??處附近測得有最大吸收峰，故采用４９０?ｎｍ作為最大吸收波長。??ＡＱ??６．０－３??５．５?ｉ??５－〇￣ｉ?柳?ｎｍ??４．５４??－ＳＳＧＲＰ?ｎ??Ｏ－Ｏ－ｌ?１?１?１￣￣?？—ｉ—￣＾?＂Ｔ?????Ｚ）０?３００?４００?５００?６００?７００?８００??Ｗａｖ?ｄ?ｅｎｇｔｈ?（ｎｍ）??圖２－２?土茯苓粗多糖樣品紫外光譜掃描??２．?４．?２．?３總糖含量的測定??根據(jù)苯酚－硫酸法，顯色后用酶標(biāo)儀測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，根據(jù)不同??濃度的無水葡萄糖及對應(yīng)的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為??Ｙ＝０．００２７ｘ＋０．?０７０８?（?Ｒ２＝０．?９９８３，線性范圍：１．９５－１０００?阽／ｍＬ）。計算測得土茯苓粗??１４??
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