目的研究益氣逐瘀解毒顆粒調(diào)節(jié)Girdin表達治療大鼠肝纖維化的作用機制。方法將123只SD雄性大鼠隨機分成模型對照組和空白對照組,模型對照組予以CCL4、橄欖油混合液(2:3),皮下注射造模,7周后將模型組大鼠隨機分成中藥高、中、低劑量組,陽性對照組,模型對照組,原空白對照組不變。中藥組即益氣逐瘀解毒顆粒高、中、低三個劑量組,陽性對照組用扶正化瘀膠囊干預,模型對照組和空白對照組等體積蒸餾水灌胃,5周后處死大鼠,取肝臟、血清標本,進行相關指標檢測:(1)采用HE、MASSON染色法檢測肝組織損傷及肝纖維化病理指標;(2)ELISA法檢測血清HA、LN表達水平;(3)生化實驗法檢測血清肝功指標ALT、AST、γ-GT水平;(4)RT-PCR法檢測肝纖維化相關因子MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、Col1A1、Col1A2的表達;(5)RT-PCR法檢測肝纖維化相關通路中關鍵因子PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3、PKA、CREB的表達;(6)RT-PCR法、Western Blot、免疫組化法檢測Girdin的表達(7)免疫組化法檢測肝組織中α-SMA表達;結(jié)果1、CCL4造模結(jié)果(1)一般情況:除空白對照組外,模型對照組大鼠精神狀態(tài)及飲食變化明顯,大小便異常,注射藥物部位皮膚潰爛,毛發(fā)臟亂、粗糙,脫落明顯,有死亡情況。肝標本大體情況:造模結(jié)束可見肝標本萎縮,體積變小,色暗、無光澤,表面顆粒樣凸起明顯,質(zhì)硬。(2)造模病理結(jié)果:肝纖維化形成,纖維間隔由中央靜脈和匯管區(qū)向周圍延伸,分割肝小葉,并有明顯形成假小葉的趨勢,肝纖維化分級達到3級或以上。2、益氣逐瘀解毒顆粒治療結(jié)果(1)一般情況:治療組大鼠的精神狀態(tài)良好、飲食可、皮毛及色澤較造模時有顯著改善,皮下潰爛逐漸好轉(zhuǎn),大鼠體重均明顯增加。(2)肝臟標本大體情況:益氣逐瘀解毒顆粒各劑量組,肝臟色紅,有光澤,表面光滑,無顆粒樣凸起,質(zhì)地均勻,邊緣稍鈍;陽性對照組少數(shù)肝臟色暗,無光澤,質(zhì)較硬,萎縮、邊緣鈍;模型對照組大多數(shù)肝標本色暗,無光澤,萎縮,質(zhì)硬,周圍圓鈍;空白對照組肝臟標本色鮮紅,有光澤,質(zhì)軟,邊緣銳利。(3)病理指標檢測結(jié)果:益氣逐瘀解毒顆粒各劑量組,膠原纖維含量與模型對照組比較明顯減少,肝小葉結(jié)構清晰,纖維組織主要分布在匯管區(qū)、中央靜脈及其周圍,低劑量組部分病理切片可見形成較細條索狀結(jié)構甚至向周圍延伸;陽性對照組中僅有少數(shù)出現(xiàn)小葉結(jié)構被較粗的纖維間隔分割;模型對照組多數(shù)肝臟病理切片的肝小葉被較粗的纖維間隔分割;空白對照組僅少數(shù)膠原纖維分布于匯管區(qū)、中央靜脈。MASSON染色半定量評分結(jié)果:益氣逐瘀解毒顆粒高劑量組與模型對照組比較,評分顯著降低(p0.01)。(4)生化指標檢測結(jié)果:各組肝功均在正常范圍。與空白對照組比較,模型對照組AST、ALT、γ-GT水平顯著升高(p0.05);與模型對照組比較,益氣逐瘀解毒顆粒高劑量組AST、ALT、γ-GT的水平顯著降低(p0.05);(5)ELISA法檢測肝纖維化指標LN水平的結(jié)果:模型對照組與空白對照組比較,LN水平顯著升高(p0.01);與模型對照組比較,各個藥物干預組中均可見LN顯著降低(p0.05);益氣逐瘀解毒顆粒低劑量組與陽性對照組(扶正化瘀組)比較,LN含量顯著下降(p0.05).(6)RT-PCR法檢測大鼠肝組織中MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、Col1A1、Col1A2表達的結(jié)果:與空白對照組比較,模型對照組MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表達量顯著下降(p0.05),TIMP-1、Col1A1、Col1A2表達顯著升高(p0.05);與模型對照組比較,益氣逐瘀解毒顆粒高劑量組MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表達量顯著升高(p0.05),TIMP-1、Col1A1、Col1A2表達顯著下降(p0.05);(7)RT-PCR法檢測大鼠肝組織中Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3、PKA、CREB表達結(jié)果:(1)與空白對照組比較,模型對照組Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3的表達顯著升高(p0.05),PKA、CREB的表達顯著下降(p0.05);(2)與模型對照組比較,益氣逐瘀解毒顆粒高劑量組Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3表達顯著下降(p0.05),PKA、CREB的表達顯著顯著升高(p0.05);(3)與陽性對照組比較,中藥高劑量組Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3表達顯著下降(p0.05),PKA、CREB的表達顯著顯著升高(p0.05);(8)Western Blot、免疫組化法檢測肝組織中Girdin的表達結(jié)果:(1)與空白對照組比較,模型對照組Girdin表達量顯著升高(p0.01);(2)與模型對照組比較,中藥高劑量組Girdin表達量顯著下降(p0.05);(9)免疫組化法檢測肝組織中α-SMA表達結(jié)果:(1)與空白對照組比較,模型對照組α-SMA表達量顯著升高(p0.01);(2)與模型對照組比較,各個治療組α-SMA表達量顯著下降(p0.01);(3)與陽性對照組比較,益氣逐瘀解毒顆粒高、中劑量組α-SMA表達量顯著下降(p0.05);(4)益氣逐瘀解毒顆粒低劑量組與陽性對照組比較,無顯著差異(p0.05);結(jié)論1、皮下注射CCL4成功構建肝纖維化大鼠模型;2、益氣逐瘀解毒顆粒具有抗肝纖維化作用;3、益氣逐瘀解毒顆粒能通過下調(diào)Girdin表達,使促纖維化信號通路受抑,最終起到治療肝纖維化的作用;
【學位單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
縮略詞及中英文全稱
中文摘要
Abstract
前言
1、實驗材料
    1.1 實驗動物
    1.2 實驗藥物
    1.3 主要試劑
    1.4 主要試劑的配制
    1.5 實驗儀器、器材
2、實驗方法
    2.1 CCL4肝纖維化大鼠模型制備
    2.2 益氣逐瘀解毒顆粒灌胃治療
    2.3 大鼠一般情況及肝標本的大體觀察
    2.4 標本收集
    2.5 指標檢測
3、實驗結(jié)果
    3.1 肝纖維化模型制備結(jié)果
    3.2 治療期間觀察
    3.3 益氣逐瘀解毒顆粒治療的結(jié)果
討論
    1、益氣逐瘀解毒顆粒的來源及藥物組成
        1.1 益氣逐瘀解毒顆粒的來源
        1.2 益氣逐瘀解毒顆粒的方解
        1.3 益氣逐瘀解毒顆粒的藥物組成
    2、關于陽性藥物選擇依據(jù)
    3、模型制備方法的選擇
    4、HE、MASSON染色及血清HA、LN、ALT、AST、γ-GT在肝纖維化診療中的意義
        4.1 HE、MASSON染色在肝纖維化診斷中的意義
        4.2 血清HA、LN在肝纖維化診斷中的意義
        4.3 ALT、AST、γ-GT在肝纖維化中的作用討論
    5、肝纖維化發(fā)生機制探討
        5.1 肝纖維化與α-SMA、TGF-β1 的相關性
        5.2 肝纖維化與MMPs、TIMPs的相關性
    6、肝纖維化與Girdin的相關性
        6.1 Girdin與HSCs的相關性
        6.2 Girdin對肝纖維化相關信號通路的調(diào)控
總結(jié)及展望
參考文獻
致謝
附圖
實驗路線圖
綜述
    參考文獻
在讀期間公開發(fā)表的學術論文、專著及科研成果

【參考文獻】

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本文編號：2855305